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猪链球菌病是危害养猪业的一个重要传染病,可引起猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎等,给养殖业造成很大的经济损失。猪链球菌是其最主要的病原之一,根据其荚膜多糖抗原的差异,可将其分为35个血清型,其中1、1/2、2、7、9、14型是其主要致病性血清型,给养殖业造成很大的经济损失。同时,它也是一种重要的人兽共患病,可引起人的败血症、脑膜炎和永久性耳聋等,甚至引起死亡,在公共卫生方面引起极大关注。本研究旨在建立快速特异的免疫学和分子生物学检测方法,同时对河南省病猪群中猪链球菌的感染状况及血清分布进行调查,为该病的快速诊断和防制提供参考。1、猪链球菌主要致病血清型PCR检测方法的建立根据猪链球菌种特异的gdh基因序列及1(14)、2(1/2)、7、9型型特异的cps1I、cps2H、cps7H、cps9G基因序列,分别设计了5对引物,预计扩增目的片段分别为689bp、441bp、542bp、232bp和330bp。通过优化反应体系,分别建立了快速检测猪链球菌种及其1(14)、2(1/2)、7型的四重PCR方法和猪链球菌9型的单一PCR方法。利用保存的猪链球菌不同血清型菌株和其他相关标准菌株为参照进行特异性和敏感性试验。用所建立的PCR方法对河南省不同地市的39份猪扁桃体样品进行检测,并选取部分样品通过PCR产物序列测定进行了验证。所建立的PCR法特异、敏感,其中四重PCR对猪链球菌2型的最低检出水平为2.52CFU。该PCR法准确性很好,可用于猪链球菌主要致病血清型的快速检测。2、河南省发病猪群猪链球菌的分离、PCR鉴定及其血清型分布利用所建立的PCR方法,对河南省14个地市33个猪场采集的83份发病猪扁桃体样品进行PCR检测,同时分离疑似猪链球菌,进行形态学、染色特性鉴定、并用猪链球菌种及其主要致病血清型PCR方法进行鉴定,再抽取部分PCR产物进行序列测定进行验证。扁桃体样品中共检测出猪链球菌阳性77份,检出率为92.8%,其中2型15份,占18.1%;7型4份,占4.8%;9型26份,占31.3%;没有检测出血清1型;同时检出2型和7型的有8份,9.6%;同时检出9型和7型的有2份,占2.4%;共分离到猪链球菌菌株77株,其中2型7株,占9.2%;7型3株,占4.0%;9型4株,占5.3%;未定型的63株,占81.8%;没有分离到血清1型。分离到的猪链球菌均为针尖状大小、灰白色或灰色、呈α、β、γ溶血的小菌落,革兰染色均为阳性球菌,一般成对或短链状,偶有长链。结果说明河南省病猪群中猪链球菌的携带率很高,主要为血清9型,其次是2型,7型较少;未发现1型。猪链球菌致病血清型常与HCV,PCV2等混合感染;分离到的猪链球菌菌株较纯,可作为背景明确可靠的实验材料用于今后的生产和科研。3、猪链球菌谷氨酸脱氢酶(GDH)基因的克隆与序列分析PCR扩增出猪链球菌1、2、7、9及其它未定型菌株共5个菌株的gdh基因,克隆于pMD-18T载体,转化宿主菌JM109中进行序列测定。并从GenBank中下载猪链球菌2、7、9型gdh基因序列共16个,对其进行比较分析。成功克隆了5株猪链球菌的gdh基因,序列分析显示其gdh基因与GenBank中已登录的猪链球菌gdh基因有密切的亲缘关系,21株不同血清型菌株gdh基因的核酸同源性96.4%～100%;其推导的氨基酸序列同源性在98.4%～100%,最高只有5个氨基酸的差异。15株血清2型菌中,该基因的核苷酸同源性在99.9%～100%,氨基酸同源性在99.6%～100%,其中有13株为100%,另2株仅有一个氨基酸的差异。对21个菌株的氨基酸序列比较发现,6个血清2型之外菌株的氨基酸序列都有3处氨基酸存在差异,分别发生在299aa处,Ser→Ala,305aa和330aa处,Lys→Glu。除此之外,个别序列在其它位点与2型仅存在1或2处氨基酸的差异。该蛋白抗原性预测显示其共含21-22个抗原表位,BLAST分析显示有13-14个表位是特异性的抗原表位。表明所克隆的基因在猪链球菌之中非常保守,可以进行表达以用作免疫学方面的相关研究。4、猪链球菌血清2型PDSWG-1株gdh基因及9型荚膜多糖cps9G基因的原核表达设计2对引物,分别采用PCR法以猪链球菌2型河南分离株PDSWG-1及猪链球菌9型河南分离株PY-2的基因组DNA为模板扩增出gdh和cps9G全基因。用限制性核酸内切酶BamHⅠ、XhoI进行双酶切后,定向克隆至pET32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a-gdh和pET32a-cps9G,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行鉴定。通过优化表达条件,pET32a-gdh/BL21经0.8 mmol/L IPTG诱导3h后SDS-PAGE分析表明,重组菌株表达出了约68.8KDa的融合蛋白条带,与预期结果一致。pET32a-cps9G/BL21经1.2 mmol/L IPTG诱导4h后SDS-PAGE分析表明,重组菌株表达出了约50.7KDa的融合蛋白条带,与预期结果一致。Western blotting分析表明,这两个融合蛋白均具有特异的生物学活性。为建立快速、简便、特异的免疫学检测方法及制备单克隆抗体提供了较好的抗原,同时为研制猪链球菌亚单位疫苗和诊断试剂盒奠定了基础。