背景种植义齿迄今已成为牙列缺损及牙列缺失修复方式的主要趋势,其高成功率常见于报道,但仍不乏失败案例。种植义齿的成败取决于其是否达到良好的骨结合方式,成骨细胞的成骨作用与破骨细胞的骨吸收作用的动态平衡在骨性愈合中起到决定性作用,同时与其生物力学因素密切相关。骨性愈合的种植体受到负载后通过种植体将(牙合)力传导到种植体-骨界面,如(牙合)力过大将导致种植体周围骨的吸收、丧失,甚至种植体松动、脱落,最终造成种植失败。因此,很多学者将研究的重点集中到影响(牙合)力传导的各个方面,如颌骨骨质、种植体形态、上部结构的设计、(牙合)力和材料种类等,方法多采用二维、三维有限元分析以及光弹分析等。而直接针对种植界面的生物力学传导及其生物学效应的研究很少,对种植体细胞界面的细胞生物力学研究除本课题组的前期研究外则鲜有报道。骨的三维网状结构中骨细胞执行着力学传感和力学信号转导的作用。当骨或者植入种植体负载时,细胞周围的未矿化基质产生挤压,从而在骨细胞胞膜表面产生流体剪切力。Klei-Nulend等证实骨细胞受到流体流动的作用而被激活。也有研究证明成骨细胞在流体力的作用下也可产生类似反应。种植体-骨界面细胞在流体剪切力的作用下必然发生从形态到功能转变的生物学反应,其过程伴随着一系列信号转导,而其中哪些信号分子扮演着何种角色尚不完全清楚。由于Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤细胞的生长增殖关系密切,过往研究一般将其作为肿瘤治疗研究的靶点,而近年来发现此通路中的一个跨膜共受体分子----低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Lrp5)基因突变可导致骨相关疾病。Lrp5功能缺失突变可致骨组织成骨细胞数目减少,对力学加载的响应下调,骨密度下降；其功能获得性突变则使成骨细胞数目增加,组织对力学加载的响应更敏感,骨密度增高。除此因子,通路中其余相关分子,如wnt蛋白、Lrp6、DKK1、β-catenin等基因突变均可导致不同程度的骨代谢异常。因此Wnt/β-catenin信号通路逐渐成为与骨组织相关的细胞生物力学研究的热点。但由于各实验组采用不同的实验条件,对于Wnt/β-catenin信号通路在骨形成过程中的作用尚无统一认识。第一章：流体剪切力对不同钛表面原代成骨细胞Wht/β-catenin信号通路关键成员mRNA表达的影响目的本课题旨在模拟体内环境建立种植体细胞界面应力作用体外模型,观察流体剪切力及表面微形貌对种植体细胞界面原代成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法1.取新生一天SD大鼠颅骨,采用二次酶消化连续组织块培养法作原代成骨细胞培养。原代成骨细胞鉴定：碱性磷酸酶染色及矿化结节茜素红染色。2.采用不同方法制备抛光处理纯钛钛片(P组)、喷砂酸碱处理纯钛钛片(S组)。表面形貌定性检测：扫描电镜(SEM)观测表面微形貌。3.将大鼠原代成骨细胞分别接种于玻片(G组)、P组钛片、S组钛片表面,培养72小时后,实验组置于流体加载系统中,施加12dynes/cm2流体剪切力,分别作用0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h;对照组在2%血清的培养液中静置0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h4.处理后提取细胞RNA,通过实时荧光定量PCR检测Lrp5和β-catenin mRNA的表达量。结果1.实验所用培养方法能在较短时间内获得较多原代成骨细胞,所得大鼠原代成骨细胞生长良好,碱性磷酸酶染色呈蓝紫色,并可见部分深染颗粒；培养4周形成多个肉眼可见白色的矿化结节,茜素红染色呈鲜红色,符合成骨细胞生物学特征。2.纯钛钛片表面处理后呈现不同表面形貌。P组表面为方向一致的划痕。S组呈现微米级、纳米级多级孔洞结构。3.经析因分析,表面处理因素、流体剪切力力学因素及时间因素三因素对细胞Lrp5和β-catenin mRNA表达量的差异均有统计学意义(P均小于0.001)。提示细胞Lrp5和β-catenin mRNA的表达有表面依赖性、力学刺激依赖性及加载时间依赖性。实验组基因表达量明显高于对照组,S表面基因表达量明显高于G、P两表面。两目标因子mRNA水平在流体剪切力作用下均在0.5-1h内达到峰值。受力情况下两种钛表面Lrp5mRNA均在0.5h达高峰,G组Lrp5mRNA在1h达高峰,而β-catenin mRNA在三种表面的高峰均出现在0.5h。在S组表面,Lrp5和β-catenin mRNA均呈骤升后下落再缓升的趋势。说明流体剪切力和喷砂酸碱处理钛表面均能促进原代成骨细胞Lrp5和β-catenin mRNA的表达上调,并且其表达水平峰值出现在加力时间早期。第二章：流体剪切力对不同钛表面MG63细胞Wnt/β-catenin信号通路关键成员mRNA表达的影响目的通过检测不同成骨样细胞对相同处理的反应与原代成骨细胞进行对比,进一步探讨Wnt/β-catenin信号通路在成骨细胞发挥功能过程中的作用。方法1.采用不同方法制备抛光处理纯钛钛片(P组)、喷砂酸碱处理纯钛钛片(S组)。2.将MG63细胞复苏传代培养,分别接种于玻片(G组)、P组钛片、S组钛片表面,培养72小时后,实验组置于流体加载系统中,施加12dynes/cm2流体剪切力,分别作用0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h;对照组在2%血清的培养液中静置Oh、0.25h、0.5h、1h、2h、4h3.处理后提取细胞RNA,通过实时荧光定量PCR检测Lrp5和β-catenin mRNA的表达量。结果1.从本实验结果可得,力学因素并不能显著引起MG63细胞Lrp5mRNA表达的变化,而其P值处于临界值,若能增大样本量,可能会出现统计学差异；不同表面可引起Lrp5mRNA表达的不同,其中喷砂酸碱处理表面在本实验时间段内(0-4h)静止的情况下下调了Lrp5mRNA的表达水平,而受力的情况下三表面无明显差异；而从时间趋势上分析,受力情况下,玻片表面Lrp5mRNA呈现双峰,光滑钛表面及喷砂酸碱处理表面Lrp5mRNA呈随时间推移逐渐上调的趋势,呈线性相关,推测在持续受力4h以后,两种钛表面Lrp5mRNA表达可能继续上调。2.对于β-catenin,力学因素则能引起其mRNA表达的变化,表现为12dynes/cm2的FSS能够上调β-catenin mRNA水平；表面因素却对其无明显影响；从时间趋势上分析,与Lrp5相似,受力情况下,玻片表面β-catenin mRNA呈现双峰,光滑钛表面及喷砂酸碱处理表面β-catenin mRNA呈随时间推移逐渐上调的趋势,呈线性相关,推测在持续受力4h以后,两种钛表面β-catenin mRNA表达可能继续上调。3.结合Lrp5与β-catenin的结果分析,FSS能促进MG63细胞β-catenin mRNA水平上调,而对Lrp5mRNA却无明显影响；不同表面对Lrp5mRNA影响不同,喷砂酸碱处理钛表面使MG63细胞Lrp5mRNA水平下调,而表面因素对β-catenin mRNA水平却无明显影响；两目标因子mRNA均表现出随受力时间的不同而变化,其中玻片表面mRNA表达水平均在0.5h、2h呈双峰,光滑钛表面及喷砂酸碱处理钛表面mRNA表达水平均呈随受力时间延长而上调。第三章流体剪切力对不同钛表面MG63细胞Wnt/β-catenin信号通路关键成员蛋白表达的影响目的通过检测MG63细胞Wnt/β-catenin信号通路相关成员蛋白水平的表达变化,进一步探讨流体剪切力及钛表面对此通路的影响。方法1.采用不同方法制备抛光处理纯钛钛片(P组)、喷砂酸碱处理纯钛钛片(S组)。2.将MG63细胞分别接种于玻片(G组)、P组钛片、S组钛片表面,培养72小时后,实验组置于流体加载系统中,施加12dynes/cm2流体剪切力,分别作用Oh、0.25h、0.5h、1h、2h、4h;对照组在2%血清的培养液中静置0h、0、25h、0.5h、1h、2h、4h3.处理后消化收集细胞进行胞浆蛋白及核蛋白分离提取,分别用来进行Lrp5和β-catenin的Western blot检测。结果1.静止组Lrp5蛋白表达水平比受力组高,表明12dynes/cm2的FSS抑制了MG63细胞Lrp5蛋白的表达。两种钛表面的蛋白表达水平均比玻片表面要低,但粗糙钛表面与光滑钛表面之间无显著差异,表明此条件下钛表面可能抑制了Lrp5蛋白的表达,粗糙表面的性质未必能影响Lrp5蛋白的表达。受力和静止的情况下,Lrp5蛋白的表达均随时间变化而有差异,且在FSS作用下,其表达水平与时间呈线性相关,G组和P组水平均随时间迁移而下调,S组则随时间迁移而上调。2. β-catenin蛋白的表达有力学因素、表面因素依赖性,不同时间点在受力情况下有统计学差异(P<0.05)。受力组蛋白表达水平比静止组高,说明12dynes/cm2的FSS促进了MG63细胞β-catenin蛋白在核内的表达。静止情况下G组表达水平最低,S组与P组无显著差异,而受力情况下S组水平最高,P组水平最低,说明不同表面可影响β-catenin蛋白在核内的表达,粗糙表面能促进FSS作用下β-catenin蛋白向核内转运。相关性分析显示β-catenin蛋白水平与时间并无线性相关,三种表面蛋白表达水平均在早期出现高峰。3.结合Lrp5和β-catenin结果分析,12dynes/cm2的FSS促进β-catenin蛋白向核内转运,同时抑制了胞质Lrp5蛋白的表达；钛表面可能抑制了Lrp5蛋白的表达,粗糙表面的性质未必能影响Lrp5蛋白的表达,在受力情况下能促进β-catenin蛋白向核内转运；两种蛋白的表达均随受力时间的长短而变化。结论大鼠原代成骨细胞与人成骨肉瘤细胞MG63对力学、表面因素的响应不同,其在生物分子水平的信号转导变化也表现出明显差异。适宜大小的FSS以及喷砂酸碱处理钛表面均能促进原代成骨细胞Lrp5及β-catenin的基因转录,从而可能上调了Wnt/β-catenin信号通路,并且喷砂酸碱处理钛表面可能提高了原代成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路对FSS刺激的敏感性。而在MG63细胞中,FSS可能未经Wnt/Lrp5信号途径激活β-catenin下游信号通路,而随受力时间的延长,不同表面的信号通路可能再次发生不同的转变,Lrp5mRNA和蛋白水平在喷砂酸碱处理表面的下调,推测此表面可能抑制了MG63细胞的经典Wnt/Lrp5信号。