为了满足日益增多的化学物质致癌活性检测的需要，本研究拟建立恶性转化前的非转化人细胞株并探讨其致癌活性检测的可行性，目的在于完善目前所采用的体外代谢系统，建立稳定的、操作简便、灵敏度高的细胞检测模型。 研究内容及方法： 1.细胞模型的构建 1.1转基因细胞模型的构建 利用逆转录病毒载体介导的基因转导方法于永生化人支气管上皮细胞16HBE中导入人端粒酶催化亚基hTERT或空白载体，通过端粒重复序列扩增法检测端粒酶的活性；用P450-GLOTM检测CYP1A1酶活性。 1.2DNA修复基因缺陷细胞的构建 利用慢病毒载体介导的细胞转染技术，把4种DNA修复基因共济失调-毛细血管扩张突变基因、切除交错互补修复基因1、切除交错互补修复基因2、错配修复基因的短发夹双链RNA载体导入永生化人胚肾上皮细胞株，并设立靶向干扰荧光蛋白的shRNA载体作为对照。嘌呤霉素筛选后分别命名HEK-shATM，HEK-shERCC1，HEK-shERCC2，HEK-shMLH1和HEK-shGFP。RT-PCR验证DNA修复基因沉默细胞株ATM、ERCC1、ERCC2、MLH1mRNA的表达。 2.细胞生物学特性观察 通过对细胞的形态学观察、生长曲线、倍增时间、染色体畸变、软琼脂克隆形成情况及裸鼠皮下成瘤情况，观察转基因及修复基因沉默对细胞生物学特性的影响。以DNA修复基因沉默细胞为靶细胞，1.0μg/ml丝裂霉素MMC染毒，观察DNA修复基因沉默细胞对MMC遗传损伤的敏感性。 3.环氧二醇苯并芘、硫酸镍、甲硝基亚硝胍、佛波酯诱导细胞转化试验 首先用台盼蓝染色法测定细胞毒性，根据细胞存活率计算半数致死浓度，选择LC50的30％作为染毒的最高剂量。BPDE、NiSO4、MNNG作用于16HBE细胞的LC50分别是4.5μM、774μM、15μM。DMSO作为溶剂对照组。以转化细胞HEKTRST作为阳性对照。将细胞消化后按5×104个每孔的密度接种到6孔培养板，每组设3个平行样。染毒24小时后弃上清液，加入新鲜培养基。每周染毒一次，共4次。于初次染毒后第5周开始，每3周将染毒后的细胞接种到软琼脂，将能够连续两周在软琼脂中形成克隆的细胞接种到裸鼠皮下验证其恶性转化表型。观察各转基因细胞模型及DNA修复基因沉默细胞模型对化学物质诱导转化的敏感性。 4.B(a)P的代谢活化及诱导细胞的转化 采用3种方式代谢活化B(a)P：加入S9-mix、过度表达CYP1A1、染毒前用1μM低剂量B(a)P诱导HBETR细胞48小时。计算加入S9-mix或未加入S9-mix下B(a)P作用于HBE细胞的LC50，分别足10μM和80μM。加入S9-mix时B(a)P染毒浓度是0.1μM、0.5μM和1μM，染毒6个小时；HBETR-1A1和HBETR-IN细胞的染毒浓度5μM、10μM和20μM，染毒24小时。细胞消化后按5×104个每孔的密度接种到6孔培养板，设3个平行样，染毒24小时弃上清液，加入新鲜培养基。每周染毒一次，共4次。于第5周进行软琼脂实验及裸鼠皮下成瘤试验，每3周进行一次，观察3种方式代谢活化B(a)P和诱导细胞转化的能力。 结果： 1.转基因细胞模型及DNA修复基因缺陷细胞模型的建立 RT-PCR检出HBET细胞hTERTmRNA表达，蛋白印迹法验证了HBET细胞HA的表达，端粒酶活性检测表明HBET细胞中端粒酶活性明显增高；蛋白印迹检测结果显示，癌基因H-Ras，c-Myc及猿猴病毒SV40ST的蛋白表达升高；RT-PCR验证HBETR-1A1细胞CYP1A1mRNA的表达，蛋白印迹结果表明HBETR-1A1细胞CYP1A1蛋白的表达是对照HBETR-V细胞的2.7倍，酶活性的检测结果表明HBETR-1A1细胞CYP1A1酶活性是对照HBETR-V细胞的5.5倍；HBETFRST和HBETMST细胞于荧光显微镜下发现约80％细胞表达荧光，表明转基因细胞株HBET、HBETM、HBETR、HBETR-1A1、HBETRST、HBETMST构建成功。从RT-PCR的结果可见，各修复基因ATM、ERCC1、ERCC2、MLH1均有不同程度的抑制，表明几种修复基因沉默细胞构建成功。 2.细胞的生物学特性 2.1细胞形态及生长特性的观察 hTERT、癌基因H-Ras、c-Myc及CYP1A1的表达未使细胞在形态学上发生明显改变，但SV40ST的导入使细胞体积增大，细胞失去接触抑制，呈重叠生长。端粒酶催化亚基hTERT的导入使细胞的增殖速度明显加快，而癌基因H-Ras、c-Myc和SV40ST的导入进一步加快细胞的增殖速度。 2.2染色体畸变分析 在计数的100个中期相细胞中，染色体畸变以染色体数目异常为主，偶见染色单体断裂的结构异常,差异无显著性，提示癌基因的导入未引起细胞染色体畸变率明显的改变。 2.3细胞转化活性检测 把上述构建的几种细胞接种在软琼脂中，观察细胞形成克隆的情况，结果发现除了HBETMST和HBETRST两株细胞在软琼脂中形成大量的克隆，其它几株细胞HBET、HBETM、HBETR和HBETR-1A1未见克隆生长。将HBETMST和HBETRST两株细胞接种于裸鼠皮下，接种后13天形成肉眼可见的肿瘤，而其它细胞均不能在裸鼠皮下形成肿瘤。结果表明细胞在永生化基础上表达癌基因H-Ras或c-Myc，不足以使细胞发生恶性转化，但是SV40ST的导入最终诱导细胞发生恶性转化。 2.4DNA修复基因沉默影响 丝裂霉素C诱导的DNA损伤效应DNA修复基因沉默细胞HEK-shATM、HEK-shERCC1、HEK-shERCC2、HEK-shMLH1在细胞形态、生长速度以及染色体畸变率方面没有差别，细胞均未能在软琼脂中形成克隆和在裸鼠皮下成瘤，提示DNA修复基因ATM、ERCC1、ERCC2、MLH1的沉默并没有影响细胞的生物学特性。 MMC作用后各细胞株微核率均于染毒后24h达到高峰，与对照相比差异有显著性；MMC于染毒24小时撤掉后对各细胞株的微核率下降过程的动态观察发现：对照组在染毒后的60h，微核率基本下降至正常，表明DNA修复基因ERCC2、ATM的沉默使细胞对化学物质作用的敏感性增高。 3.BPDE、NiSO4、MNNG、TPA诱导细胞的转化 3.1HBETR、HBETM、HBETV细胞转化敏感性的比较 HBETR、HBETM、HBETV细胞在软琼脂中的克隆形成数与染毒剂量之间存在着剂量-反应关系。提示癌基因H-Ras和c-Myc高表达可缩短细胞转化的间期，提高细胞转化效率，H-RasVI2高表达较c-Myc更为敏感。 3.2HBETR和HEKTR细胞转化敏感性的比较 HBETR与HEKTR细胞相比，在BPDE、NiSO4、TPA、MNNG诱导的细胞转化试验中较HEKTR细胞敏感，转化间期较HEKTR细胞缩短4-6周。虽然两种细胞对MNNG诱导转化的敏感性一样，但发现HBETR细胞克隆形成率较HEKTR细胞高。提示致癌物诱导的细胞转化具有靶细胞特异性。 3.3NiSO4、MNNG、TPA诱导DNA修复基因沉默细胞转化试验 DNA修复基因沉默细胞HEK-shATM、HEK-shERCC1、HEK-shERCC2、HEK-shMLH1在NiSO4、MNNG、TPA作用下，观察20周均未发现细胞发生转化。提示几种DNA修复基因沉默细胞对NiSO4、MNNG、TPA诱导的细胞转化不敏感。 4.B(a)P的代谢活化及诱导细胞的转化 采用3种方式代谢活化B(a)P：加入S9-mix、过度表达CYP1A1、染毒前用1μM低剂量B(a)P诱导HBETR细胞48小时(HBETR-IN)。结果与酶活性及蛋白表达水平相一致。 结论： 1.成功构建了癌基因H-RasVI2和癌基因c-Myc高表达的转基因细胞株，所构建的细胞株生长速度加快，但生长形态、染色体畸变、锚着独立性生长等生物学特性无明显改变，未能获得恶性转化的表型。在高表达H-Ras和c-Myc的基础上继续导入SV40ST能诱导细胞发生恶性转化。 2.应用RNA干扰技术成功构建了DNA修复基因ATM、ERCC1、ERCC2、MLH1沉默细胞株，所构建的细胞株在生长形态、生长速度、染色体畸变、锚着独立性生长等生物学特性无明显改变，未能获得恶性转化的表型。其中ATM和ERCC2基因沉默细胞对丝裂霉素C诱导的DNA损伤作用敏感性增高。DNA修复基因沉默细胞模型对致癌物诱导的细胞转化不敏感。 3.H-RasVI2和癌基因c-Myc高表达可缩短细胞转化的间期，提高细胞转化效率，H-RasVI2高表达较c-Myc更为敏感。致癌物诱导的细胞转化具有靶细胞特异性。 4.三种代谢系统：大鼠肝微粒体组份S9、B(a)P低剂量诱导和细胞高表达CYP1A1均能够促进间接致癌物B(a)P的代谢活化，缩短细胞的转化间期，提高细胞转化效率。从试验操作难度、试验的重复性、结果的可靠性等几个方面比较三种代谢系统应用的可行性，低剂量诱导作为新的代谢活化的方法在细胞转化试验中有着良好的应用前景。