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研究背景：伴有皮层下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)是一种家族遗传性非动脉硬化性、非淀粉样变性脑血管病。患者中年起病，以反复缺血性脑卒中发作、进行性加重伴智力障碍等为临床特征。1993年将此病的基因定位在第19号染色体短臂，1996年确定本病有基因缺陷，为NOTCH3基因错义突变，而90％的CADASIL患者均存在基因突变。CADASIL病部分是由Notch3受体突变引起的。Notch3突变而导致的CADASIL发病的可能的机制是，认为Notch3结合配体后，受体胞内域进入细胞核传导信号，而胞外域可因蛋白分解而导致被清除。而未降解的Notch3胞外域可能是嗜锇颗粒GOM的主要成分。CADASIL病人中胞外域沉积成GOM，可能抑制平滑肌的正常代谢。但是Notch3蛋白在发病中机制如何，而有部分CADASIL临床表现的病人未见到明显的Notch3基因的突变，有否其他突变类型?是否可能通过其他机制发病?如何早期诊断和干预？都值得我们深入研究。
目的：筛选SHP基因的突变，以及分析突变所导致的SHP蛋白结构和功能改变。探讨CADASIL病人中SHP基因的甲基化状态。从而探讨SHP基因突变以及甲基化状态在CADASIL发病中的可能作用机制。
方法：
⑴所有标本均来源于西班牙Asturias中心大学医院神经与分子遗传学系。使用高保真酶PCR扩增片段以及直接测序法筛选SHP基因的外显子、内含子、启动子以及侧翼序列。
⑵提取人脑组织总RNA为模板进行RT-PCR得到SHPcDNA全段，随后使用高保真酶扩增。扩增后片段克隆至pGEM-T Easy载体，测序验证目的片段序列完全正确。使用EcoRⅠ，XbaⅠ酶切位点，分别将全长基因片段亚克隆到pcDNA3.1-GFP与pCMV-Flag真核表达载体中，通过KpnⅠ，XbaⅠ酶切位点将SHPcDNA克隆至VP-16载体上。通过基于聚合酶链反应的定点突变方法产生含突变的SHP基因表达质粒。使用lipofectamine2000进行细胞质粒转染。
⑶将质粒Flag-SHPWT，Flag-SHPR38H，Flag-SHPK170N和Flag-SHPG171A与HA-Ubiquitin真核表达质粒共同转染Hela细胞后，再用5μM的MG132(Cayman)进行处理。24小时后用500μM裂解液，裂解并收集细胞。并加入抗FLAG M2磁珠(sigma公司)在4℃，孵育4小时进行免疫沉淀。使用裂解液将磁珠洗三遍后，使用抗体anti-HA(Sigma公司)和anti-FLAG(Sigma公司)，WB法分别检测泛素蛋白以及SHP蛋白的表达量。
⑷将质粒Flag-SHPWT Flag-SHPR38H，Flag-SHPK170N and Flag-SHPG171A和HA-Ubiquitin转染Hela细胞24小时后，再用0.2μM TSA进行处理2小时，用裂解液裂解，获得全细胞提取液。用抗FLAG M2磁(sigma公司)在4℃。孵育4小时进行免疫沉淀。再用裂解液将磁珠洗三遍。免疫沉淀蛋白的Western blots检测使用抗乙酰化赖氨酸(acetylated-lysine)抗体和抗FLAG抗体。
⑸使用Promega公司的CheckMateTM哺乳动物双杂交系统试剂盒，使用pG5-luc荧光素酶报告基因系统检测。
⑹Flag-SHPWT,Flag-SHPR38H，Flag-SHPK170N和Flag-SHPG171A的体外蛋白合成是按照厂商指示使用T7启动子的TNT-T7快速偶联转录/翻译系统进行表达。GST融合蛋白的获得是通过GST，GST-ERRγ，GST-LRH1，GST-HNF4α,或GST-EID1等在大肠杆菌BL21/DE3/RIL的表达而实现的。洗掉非特异性结合的蛋白后，即对用WB检测分析捕获蛋白。
⑺所有的分子动态模拟(MD)都是使用Desmond2.2软件完成。野生型SHP的同源性模型是基于与之有相似序列的超螺旋蛋白(USP，pdb code lg2n)而构建的。SHPK170N和SHPG171A突变模型的产生是通过在SHPWT结构上分别用天门冬胺酸(aspargine)和丙氨酸(alanine)替代Lys170，Gly171残基而实现的。
⑻使用EZ DNA Methylation-GoldTM试剂盒进行DNA的亚硫酸盐(Bisulfite)转化，纯化回收样本设计引物进行扩增测序。
⑼统计分析由软件SPSS13.0 for Windows完成。资料的所有数值均以均数±标准差表示，应用单因素方差分析或students T检验进行统计分析，显著性检验水准为p＜0.01。
结果：
①正常组以及CADASI各组病人中发现了3个杂合子非同义SHP基因的SNP，其中两个新的错义突变(p.R38H，p.K170N)和一个以前报道过的突变(p.G171A)，同时首先发现了4个内含子或肩动子杂合子突变。
②外显子突变p.R38H，p.K170N突变显示了SHP蛋白在核内转运受损。p.K170N使SHP对泛素化(Ubiquitination，Ub)介导的蛋白质降解更加敏感，并且阻断了SHP蛋白的乙酰化(Acetylation)，同时使其失去抑制雌激素相关受体(Estrogen related receptor-gamma，ERRγ)和肝细胞核因子(Hepatocytenuclear factor-4α，HNF4α)的作用，而不影响对肝受体类似物-1(Liverreceptor homolog-1，LRH-1)的作用；而G171却增加了SHP基因mRNA和蛋白表达，并且SHP蛋白的抑制功能不受影响。基本上，突变的SHP与靶蛋白LRH1，E1A样分化抑制因子1(E1A-like inhibitor of differentiationl，EID1)的蛋白结合增强了。K170N明显损伤SHP，HNF4a，组蛋白去乙酰化酶1/3(HDAC1 histonedeacetylase1/3,HDAC1/3)与载脂蛋白CⅢ(apolipoprotein CⅢ，ApoCⅢ)启动子的结合。
③对SHP的分子动态模拟显示SNP突变p.G171A稳定了核受体盒，而突变K170N则促进了核受体的所有结构元素的构象失稳态。本研究显示SHP基因突变在人类普遍存在，p.K170N末端在控制与蛋白稳定相关的SHP泛素化和乙酰化过程中，以及改变其对转录激活的抑制作用中起扮演着重要角色。
④CADASIL样本中SHP基因启动子区域的甲基化水平稍高于对照组。
结论：SHP基因的单核苷酸多态性普遍存在于人类不同的组织中，发生的频率较高。我们发现的3个杂合子非同义SHP单核苷酸多态性SNP，其中两个新的错义突变(p.R38H，p.K170N)和一个以前报道的突变(p.G171A)，同时存在于病人及对照中，可能因为样本量少，没有发现显著性差异。有待于我们进一步加大样本量进行SHP突变与CADASIL关联性分析。内含子与3UTR突变在CADASIL中相对较高。有意义的是大部分这些突变发生在含有Notch3突变的CADASIL病人当中(共11例)，在无Notch3突变的CADASIL病人当中只有一例，显示在发病过程中，SHP基因与Notch3之间可能存在潜在联系。小非编码RNA经常定位于基因的内含子，而mirRNA的靶点经常在3端。现在不清楚是否这些突变改变了SHP的整体构象，阻断蛋白稳定或致使SHP失去功能，我们将在以后的研究中探索。