神经干细胞研究是当前神经科学的热点之一。神经干细胞被认为是治疗神经系统疾病最有前景的神经移植材料，有望通过细胞替代恢复神经系统功能。神经干细胞具有两个特性：自我增殖和多向分化，正好可以解决神经移植所面临的困难，因而已在神经退行性疾病的神经移植治疗方面大有作为。对于脑血管病（CVD），特别是缺血性脑血管病（iCVD），神经干细胞移植治疗刚刚起步。关于缺血区域的神经元对NSCs增殖、移行以及建立突触的影响如何，鲜有研究。因此，本实验希望通过体外共培养的方法，模拟研究缺血损伤的皮质神经元对外源性NSCs增殖、分化等生物学特性的影响，进而探讨NSCs移植治疗新皮质缺血损伤的可行性。 本实验分为两部分：第一部分包含实验一和实验二，主要内容是神经干细胞体外培养技术的建立，包括分离培养和鉴定；第二部分包含实验三和实验四，进行的是新皮质区神经元与神经干细胞的共培养实验，观察缺血神经元对NSCs的影响。 实验一中，从孕13天的昆明鼠体内取出胎鼠，分离其纹状体细胞，采用含有EGF、BFGF和N₂的无血清培养基DF12（DMEM/F12，1:1）， 第 四 军 医 大 学 硕 士 学 位 论 文一分别进行原代培养。培养3—5天后，在新皮质、海马和纹状体的培养物中均见到漂浮的神经球＊eurosphere人采用有限稀释法，将挑选出的神经球消化吹打分散后，以极低密度（5—10细胞／mL）转移接种至96孔板内，以相同培养基培养3－5天后，观察到由单细胞形成的新生神经球。 实验二中，首先将实验一获得新生神经球转移至经PLL处理过的24或48孔板内，培养2’J’时后固定，采用抗鼠nestin和羊抗鼠FITC进行免疫荧光染色。结果：绝大多数神经球呈nestin阳性。将实验一获得新生神经球转移至PLL处理过的24或48孔板内，更换培养基为含有10％FBS的DMEM，继续培养4天后，发现大量细胞平贴于培养板底面，突起丛生，交织成网，分别进行p－tubulinlll、NSE、GFAP。GalC等免疫荧光染色，各类阳性细胞均可见到。 实验三中，首先从孕18天左右的昆明种胚胎小鼠新皮质区分离出神经细胞，接种入Millicell（见实验三讨论）中，原代培养三天后加入阿糖胞昔，似此纯化培养7天后获得较纯的神经元，进行类缺血处理（无糖乏氧15分钟），然后将其同实验一得到的异体神经干细胞进行细胞隔离性共培养，同时设立共培养对照组（正常新皮质细胞与神经干细胞的隔离性共培养）和空白对照组（单独神经干细胞培养），通过MTT法观察各组神经干细胞的增殖情况，并绘制生长曲线；通过染色计数的方法观察各组神经干细胞分化为神经元盼惰况（为实验四）。结果：神经干细胞与缺血损伤的皮质神经元共培养后，增殖速度加快，其相对增长率为0刀575，7．59天后达最大增长速度。共培养对照组的相对增长率为0刀344，8．47天后增长速度最大，空白对照组的分别为0．0387和8．引天。处理组与两对照组有显著差别（尸＜0刀5）；两对照组之问无统计学差别（P＞ o．05）。 实验四结果：各细胞爬片上均看到贴壁细胞。贴壁细胞在爬片上分布基本均匀。神经球可以形成，有少量神经球贴于爬片上，共培养4天 3 第 四 军 医 大 学 硕 士 学 位 论 文一后，贴壁细胞数量仍然不多；且实验组和对照组贴壁细胞数量无统计学差别。共培养8天后，实验组爬片上单个视野平均贴壁细胞总数、NSE阳性细胞数均较高于对照组（P＜0刀5）。 由上述实验结可得出以下结论： 1．从E13，J’鼠纹状体中可以分离出能稳定传代的NSCs。 2．缺血损伤之新皮质神经元可以促进共培养的NSCS的增殖。正 常皮质神经元无此作用。 3．缺血损伤的新皮质神经元能促进干细胞的分化，并增加其向神 经元分化的趋势。 4．可溶性信号分于的扩散，是缺血皮质神经元影响NSCS增殖、 分化的主要方式之一。 5．NSCS移植治疗汇VD导致的新皮质损伤是可行的。