小菜蛾（Plutella xylostella）是一种世界性的十字花科蔬菜害虫,对全球蔬菜生产造成严重的经济损失。近年来由于化学药剂的不合理使用,导致小菜蛾对多种杀虫剂产生了抗药性。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）属于革兰氏阳性病原微生物,Bt在产孢过程中产生的杀虫晶体蛋白能特异性杀死多种害虫。小菜蛾是第一个在田间对Bt农药产生抗药性的害虫,目前,小菜蛾对Bt的抗药性的报道中,涉及的晶体蛋白主要集中在Cry类。尤其Cry1Ac抗性机理的研究较为全面,但主要集中在Bt活性毒素与中肠上皮细胞膜受体结合的改变,而对原毒素活化的改变及害虫中肠免疫Cry毒素的研究较少。胰蛋白酶（Trypsin）是昆虫中肠中重要的蛋白水解酶,在蛋白质消化、免疫防御反应中起重要作用,并参与Bt原毒素的活化和毒性调节。micro RNAs（miRNAs）通过在转录水平上对靶基因m RNA的降解、翻译抑制而广泛参与多数真核生物的基因表达调控。但关于miRNA调控Trypsin基因的表达从而活化Cry原毒素的研究未见报道。本论文通过分子生物学,生物信息学等方法对miR-2b-3p靶向PxTrypsin-9调控小菜蛾中肠免疫Cry1Ac的分子机制进行了深入的研究。结果表明,miR-2b-3p靶向PxTrypsin-9对Cry1Ac原毒素的活化和消解发挥重要作用。主要研究内容结果如下:1.对本实验室测定的Cry1Ac处理后的小菜蛾中肠转录组RNA-Seq数据进行分析,发现,胰蛋白酶基因Trypsin-9（命名为PxTrypsin-9）的表达显著下调,且与显著差异表达的miR-2b-3p呈负相关,经miRanda、RNAhybrid和Target Scan三种软件预测都表明miR-2b-3p靶向了PxTrypsin-9,且靶标序列一致,这说明miR-2b-3p靶向PxTrypsin-9负调控其表达。随后,我们对该基因进行克隆,并对其氨基酸序列进行同源性分析,发现PxTrypsin-9与On Try9同源性较高聚为一支,推测蛋白功能较为接近。2.通过qRT-PCR对PxTrypsin-9基因表达模式的检测表明。?:PxTrypsin-9基因在小菜蛾中肠高表达,其它组织表达量较低;PxTrypsin-9基因在幼虫期表达量最高,其它发育阶段表达量很低;不同发育历期的幼虫间PxTrypsin-9基因在四龄期（暴食期）表达量最高。结果证明PxTrypsin-9基因参与小菜蛾对食物的消化。??:Cry1Ac原毒素侵染小菜蛾能显著降低PxTrypsin-9基因的表达。而miR-2b-3p的表达显著上升,这表明Cry1Ac原毒素侵染小菜蛾后PxTrypsin-9基因的表达与miR-2b-3p的表达呈负相关。3.体外构建双荧光素酶报告系统进一步研究证实,在miR-2b-3p模拟物的存在下,PxTrypsin-9转录水平显著降低;在体内向小菜蛾饲喂miR-2b-3p inhibitor,结果发现,饲喂inhibitor的24、48和60h,小菜蛾体内miR-2b-3p基因的表达水平被抑制,同时PxTrypsin-9基因的表达水平上调。4.利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术对小菜蛾PxTrypsin-9基因进行沉默,研究表明。通过显微注射技术将合成的ds RNA-PxTrypsin-9注射到小菜蛾幼虫体内,24h后PxTrypsin-9基因的表达量显著下调。同时利用注射ds RNA24后的小菜蛾中肠液与原毒素Cry1Ac孵育1h后,SDS-PAGE结果显示该中肠液对Cry1Ac原毒素的激活和消解能力有所下降。结果证明PxTrypsin-9在小菜蛾中肠对Cry1Ac原毒素的活化及防御苏云金杆菌的侵染过程中起着重要的作用。5.本文构建了p ET-32a-PxTrypsin-9原核表达重组载体,并通过宿主菌BL21在IPTG诱导的条件下进行表达,经SDS-PAGE检测PxTrypsin-9蛋白在IPTG诱导下大量表达,分子质量为45KDa,利用带有6×His标签的树脂对该重组蛋白进行纯化,为以后PxTrypsin-9蛋白功能的进一步研究奠定了基础。本论文明确了miR-2b-3p对于PxTrypsin-9基因的靶向调控及PxTrypsin-9与Bt原毒素活化的相关性,表明了PxTrypsin-9在小菜蛾对苏云金杆菌侵染的防御机制中起着重要的作用。结果为进一步阐明小菜蛾BtCry抗性的产生及为靶向特异基因的miRNA参与病虫害防治提供了理论依据。