第一部分 应用GC-MS方法研究代谢标志物在预测异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病中的作用[目的]运用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术,检测和鉴定接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)患者移植前后血浆内的代谢产物,探讨代谢标志物在急性移植物抗宿主病(aGVHD)中的作用以及与复发的关系。[方法]采用GC-MS技术检测,对苏州大学附属第一医院血液内科2012年1月至2014年5月接受allo-HSCT114例患者预处理前(-9天)、移植后第0、7、14天血浆样本共456份进行了非靶向的代谢物筛选。使用质量控制样品的峰面积相对偏差(RSD)考察GC-MS方法学稳定性;运用自动质谱退卷积定性系统(AMDIS)和美国国家标准与技术研究院(NIST)标准库结合保留指数对所检测的化合物进行物质鉴定。从114例患者中随机选择了 13例0-Ⅰ度aGVHD患者和15例Ⅱ-Ⅳ度aGVHD患者组成发现组(Discovery set),剩余患者构成验证组(Validationset)。运用t检验、受试者工作特征曲线(ROC曲线)和错误发现率(FDR)筛选aGVHD患者和非aGVHD患者间差异性代谢产物;Logistic回归建立aGVHD预测模型;Gray’s检验和竞争风险回归分析复发。[结果](1)GC-MS方法学稳定性考察。质量控制(QC)样品检测显示峰面积相对偏差(RSD)<15%的化合物比例达到69%,提示系统稳定性良好,满足分析要求。(2)血浆代谢物的鉴定。根据AMDIS和NIST标准库和保留指数,总共鉴定到16种代谢物。分别为:丙酮酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸、尿素、甘油、脯氨酸、苯丙氨酸、半乳糖、葡萄糖、软脂酸、甘露糖、亚油酸、油酸、硬脂酸和胆固醇。(3)114例患者的中位随访时间为42个月(0.2个月～60个月)。粒系造血重建的中位时间为12天(10天～37天);巨核系造血重建的中位时间为14天(8天～90天)。0-Ⅰ度aGVHD患者72例,Ⅱ-Ⅳ度患者42例。aGVHD发生的中位时间为30天。共有51例患者死亡,5年总体生存(OS)率为55.26%。共有31例患者复发,复发率为27.19%。(4)在aGVHD发现组中,通过t检验和ROC曲线分析,发现移植后第7天的软脂酸(PA)和硬脂酸(SA)在0-Ⅰ度和Ⅱ-Ⅳ度aGVHD患者之间存在差异。表现为,0-Ⅰ度aGVHD病人具有更低的PA水平和更高的SA水平。进一步对两者的比值进行分析。结果表明,第7天中SA:PA水平在两组病人中存在差异,且经过FDR控制后,差异仍然存在(p=0.02)。SA:PA的AUC达到0.836,高于PA(AUC=0.754)和SA(AUC=0.723)。SA:PA这一指标可能具有更好的诊断及预测价值。在验证组中,我们得出了相同的结论。(5)用Logistic回归对临床因素进行单因素分析,结果表明干细胞来源和供/受体性别与aGVHD的发生相关。利用上述临床因素,我们建立了四个预测模型,分别为基础模型(仅包括临床因素)、基础模型+PA、基础模型+SA以及基础模型+SA:PA。多因素分析表明,高SA降低了 Ⅱ-Ⅳ度aGVHD的发生风险,而PA升高了该病的发生风险,且具有高水平SA:PA的患者发生Ⅱ-Ⅳ度aGVHD风险更低(odds ratio[OR]=0.06,95%CI=0.02-0.18,P<0.001)。通过 ROC 曲线比较,基础模型+PA(AUC=0.722)、基础模型+SA(AUC=0.798)以及基础模型+SA:PA(AUC=0.853)的AUC均比基础模型的AUC显著性增大(AUC=0.667);而且基础模型+SA:PA的AUC面积比基础模型+PA和基础模型+SA的AUC都显著增高(p<0.001,p=0.006)。根据leave-one-out交叉验证,基础模型+SA:PA的预测准确度达到0.807,高于其他模型(基础模型0.684,基础模型+PA0.632,基础模型+SA0.746)。因此,低SA:PA比值是Ⅱ-Ⅳ度aGVHD发生的独立危险因素,且在预测aGVHD方面具有更好的效能。(6)由Gray’s检验,我们发现具有高水平SA:PA组患者的复发率要明显高于低水平组(P=0.04),而两组患者的非复发死亡率没有显著性差异(P=0.89)。在竞争风险模型中,以非复发死亡(NRM)作为竞争因素,矫正了临床因素后,高水平SA:PA组的患者较低水平组更倾向于复发(HR=2.26,95%CI 1.04-4.91,P=0.04)。因此,高水平SA:PA是移植后疾病复发的独立危险因素,在复发预测中也具有重要价值。[结论]移植后第7天血浆SA:PA比值在预测aGVHD和复发方面具有重要价值。低SA:PA 比值是Ⅱ-Ⅳ度aGVHD发生的独立危险因素,且是移植后疾病复发的独立保护因素。第二部分 应用GC-MS方法研究代谢标志物在预测异基因造血干细胞移植后疱疹病毒感染中的作用[目的]运用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术,检测和鉴定接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)患者移植前后血浆内的代谢产物,探索移植后主要的疱疹病毒CMV和EBV感染相关的潜在代谢标志物。[方法]采用的GC-MS技术方法、样本以及物质鉴定同第一部分。结合临床资料,将102例和114例患者分别纳入CMV感染和EBV感染分析。运用t检验和错误发现率(FDR)筛选CMV和EBV感染患者和非感染患者之间差异性代谢产物;Logistic回归建立疱疹病毒感染的预测模型。[结果](1)在所有患者中,无移植前检出CMV或EBV感染的情况。CMV的感染率为50.00%,其中位发生时间为2.9个月;EBV的感染率为14.91%,其中位发生时间为8个月。(2)在CMV感染分析中,运用t检验筛选到尿素(-9天、0天)、甘露糖(-9天、14天)、葡萄糖(7天)、缬氨酸(14天)和亮氨酸(14天)。进行FDR控制后,仅筛选到尿素(0天)。由于t检验中,甘露糖在多个时间点有差异,我们将14天甘露糖除以-9天甘露糖得到的比值(以下简称“甘露糖比值”)作为新的生物标记物。运用t检验对甘露糖比值分析,结果表明甘露糖比值在CMV感染组和未感染组之间存在差异,FDR控制后,依然在alpha=0.1水平具有显著性差异(p=0.05),表现为CMV感染组患者具有更高的甘露糖比值。在Logistic回归分析中,矫正临床因素后,高甘露糖比值是CMV感染发生的危险因素(OR=4.36,95%CI,1.59-12,p=0.004)。运用临床因素建立的预测CMV感染的基础模型AUC为0.732。在此模型基础上加入甘露糖后,模型AUC可以提高到0.786(p=0.09768,在alpha=0.1的水平上有显著性差异)。因此,高甘露糖比值是移植后CMV感染的独立危险因素。(3)在EBV感染分析中,运用t检验和FDR控制后具有显著性差异的代谢产物包括了:半乳糖(-9天、0天)和甘露糖(0天)。我们运用倾向评分匹配(PSM)根据临床资料将患者行1:1匹配后,对患者-9天和0天半乳糖水平的变化量(即差值)行t检验。结果表明半乳糖差值于alpha=0.10水平在Bu/Cy组和TBI/Cy组存在差异(p=0.07),于0.05水平无显著性差异。故我们根据预处理方式不同可将患者分成两组,即Bu/Cy组和TBI/Cy组。在Bu/Cy组中,运用行t检验和FDR控制未发现差异性代谢产物。在TBI/Cy组中,运用t检验和FDR控制后可以筛选到:缬氨酸(7天)、亮氨酸(7天)、半乳糖(7天)和葡萄糖(7天)。表现为在移植后第7天具有低水平缬氨酸、亮氨酸、半乳糖和葡萄糖的患者更倾向于发生EBV感染。由于缬氨酸和亮氨酸同为支链氨基酸,因此我们对其进行了主成分分析(PCA)。其中,第一主成分对比率方差的解释达到了 96.070%。我们将第一主成分定义为ValLeu(ValLeu=0.980*Val+0.980*Leu),并把它作为一个新指标。基于同样的考虑,我们对同属糖类物质的半乳糖和葡萄糖进行了主成分分析并将所得到的第一主成分定义为GalGlu(GalGlu=0.999*Gal+0.999*Glu),其对比率方差的解释率为 99.830%。在 Logistic回归分析中,我们建立了四个预测模型,分别为基础模型(仅包括临床因素)、基础模型+ValLeu、基础模型+GalGlu以及基础模型+All(ValLeu+GalGlu)。分析表明,具有高水平的ValLeu和GalGlu的患者发生EBV感染的风险更低(ValLeu OR=0.05,95%CI,0-0.68,P=0.024;GalGlu OR=0.14,95%CI,0.01-1.72,P=0.124)。对上述四个模型的ROC曲线比较后,我们发现基础模型+All的AUC(0.889)比基础模型AUC大(0.732),且具有显著性差异(p=0.04)。因此,在接受TBI/Cy患者中,缬氨酸、亮氨酸、半乳糖和葡萄糖可以作为预测EBV感染的代谢标志物。[结论]甘露糖可能是预测CMV感染的代谢标志物;在接受TBI/Cy预处理的患者中,缬氨酸、亮氨酸、半乳糖和葡萄糖则可能在预测EBV感染方面具有一定的价值。