维生素E合成途径关键酶基因的克隆及转基因植株构建

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尾穗苋(Amaranthus caudatus)为苋科苋属一年生草本植物,营养价值高,富含维生素和蛋白质,其种子中钙、铁、磷、钾、锌等元素也非常丰富,其叶子和根等具有一定的药用价值,是一种良好的牲畜蛋白质青饲料。   得益于近年来大量对植物中维生素E的合成代谢途径的研究,从拟南芥中克隆得到合成生育酚的关键酶基因,并通过农杆菌介导的转入尾穗苋中,以期提高尾穗苋中维生素E的含量,特别是α-生育酚的含量,以提高农作物的经济价值,满足人类健康对维生素E的需求。主要研究内容及结果如下:   (1)对植物激素6-BA和NAA的浓度配比进行子叶节培养基优化研究,以获得出芽率高,生长良好的高效再生体系。通过试验确定了尾穗苋子叶节再生的最佳培养基为:尾穗苋子叶节分化培养基:MS+3.0mg/L6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂粉,尾穗苋子叶节增殖培养基:MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+ 3%蔗糖+0.8%琼脂粉,pH=5.8。   (2)提取拟南芥总RNA并反转录得到尿黑酸植基转移酶(HPT,hpt/vte2)和γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT,vte4)cDNA序列,并将其取代pBI121质粒上的gus,因此成功构建了重组质粒pBI121-HPT和pBI121-TMT并转入农杆菌LBA4404中。   (3)试验结果表明:当抑菌剂头孢霉素超过300mg/L时能较好抑制农杆菌的生长,且对尾穗苋子叶节的分化与增殖影响不大;在培养基中添加150mg/L的卡那霉素能较好筛选尾穗苋子叶节;转化中在农杆菌菌液以及共培养基中添加150 μmol/L乙酰丁香酮对植株转化提高转化率具相当大促进作用;尾穗苋子叶节在农杆菌侵染前预培养24h后于OD600=0.5-0.7的菌液中侵染20-30min为宜,感染后共培养2天,延迟选择培养5天后进行筛选。   (4)植物外植体经过农杆菌介导,在一定的选择压下分化生长得到抗性芽,这只是一个初步的筛选过程,在很多情况下会存在假阳性现象。由于时间以及材料限制关系,仅对部分抗性株系进行了PCR检测,其中有2个株系出现了与阳性质粒相同的特异性片断,其大小与目的基因(vte4)的大小相符。
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