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目的：系统评价益肾通络中药治疗膜性肾病(Membranousnephropathy,MN)的有效性、安全性，分析益肾通络法治疗MN的用药规律，为益肾通络法治疗MN提供临床依据。并通过实验研究，观察自拟组方益肾通络方对MN大鼠的干预作用，以及对iRhom2/ADAM17/EGFR和相关下游信号通路的影响，探讨益肾通络方治疗MN的可能机制，为益肾通络方治疗MN提供理论依据。
方法：
第一部分Meta分析
通过计算机检索PubMed、TheCochraneLibrary、EMbase、中国知网、万方数据库、维普中文科技期刊全文数据库和中国生物医学文献数据库等中外文生物医学文献数据库，搜集中医益肾通络法治疗MN的临床随机对照试验，时间从建库至2018年12月。由两名研究员根据纳入和排除标准筛选文献，按照预先设计单独提取数据，交叉核对。用Cochrane偏倚风险评估工具对纳入文献进行偏倚风险评估，用改良后的Jadad量表对纳入文献进行质量评级，用RevMan5.3和Stata15.0进行Meta分析、敏感性分析和发表偏倚评估，系统评价益肾通络法治疗MN的疗效及安全性，并分析益肾通络法治疗MN的用药规律。
第二部分实验研究
健康雄性SD大鼠74只，随机分为正常组12只，造模组62只，造模组通过尾静脉注射C-BSA的方法构建MN大鼠模型。造模结束后随机抽取2只造模大鼠进行肾脏病理检查，证实造模成功。造模成功的大鼠随机分为模型组、盐酸贝那普利组、益肾通络方低、中、高剂量组，并给予相应药物灌胃，正常组、模型组予蒸馏水灌胃。给药4周后，留取相关标本，检测24hUTP、TP、ALB、TC、TG、AST、ALT、BUN、Scr；ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、IL-1β；免疫荧光观察肾小球IgG、C3沉积情况；光镜、电镜下观察大鼠肾脏病理改变；TUNEL法检测肾小球足细胞和肾小管上皮细胞凋亡情况；Real-timePCR检测肾组织信号通路相关分子iRhom2、ADAM17、TNF-α、HB-EGF、EGFR的基因表达；免疫组化检测肾组织足细胞标志蛋白WT-1，信号通路蛋白HB-EGF、p-EGFR，下游JNK和Fas信号通路蛋白Rac1、c-jun、c-fos、Fasl，及凋亡标志蛋白CleavedCaspase-3的表达，并用病理图像分析系统对免疫组化结果进行半定量分析。
结果：
第一部分Meta分析
共纳入17个随机对照临床试验，1238例原发性MN患者，观察组655例，对照组583例。各研究样本含量为40-98例，试验期为2-12个月。Meta分析结果显示：观察组在提高临床疗效[OR=3.22,95%CI(2.30,4.51)，Z=6.81(P＜0.0001)]，减少24小时尿蛋白定量[WMD=-1.15，95%CI(-1.64，-0.65),Z=4.54(P＜0.0001)]，升高血浆白蛋白[WMD=4.62，95%CI(2.76，6.47),Z=4.88(P＜0.0001)]、总蛋白[WMD=3.83，95%CI(0.95，6.71),Z=2.61(P＜0.05)]，改善中医证候积分[SMD=-1.90，95%CI(-2.70，-1.11),Z=4.69(P＜0.0001)]，降低甘油三酯[WMD=-0.22，95%CI(-0.24，-0.20),Z=20.89(P＜0.0001)]及血肌酐[WMD=-5.63，95%CI(-8.98，-2.27),Z=3.28(P=0.001)]方面均优于对照组。但是在降低总胆固醇[WMD=-0.59，95%CI(-1.49，0.30),Z=1.31(P=0.19)]和尿素氮[WMD=-0.91，95%CI(-2.08，0.26),Z=1.52(P=0.13)]方面未显示出明显的优势。
安全性分析：有7项研究统计了患者的不良反应，益肾通络法治疗MN的不良反应发生率[OR=0.41,95%CI(0.23,0.73)，Z=3.04(P＜0.05)]低于单纯西药治疗。
第二部分实验研究
1.生化指标比较
造模结束后，各造模组大鼠24hUTP明显高于正常组(P＜0.01)。治疗结束后，模型组大鼠24hUTP、TC、TG明显高于正常组(P＜0.01)，各治疗组大鼠24hUTP、TC、TG较模型组均明显降低(P＜0.01)；益肾通络方中高剂量组24hUTP、TC、TG水平与盐酸贝那普利组相当(P＞0.05)，均低于益肾通络方低剂量组(P＜0.01)。
治疗结束后，模型组大鼠血清TP、ALB明显低于正常组(P＜0.01)；益肾通络方中高剂量组和盐酸贝那普利组TP、ALB明显高于模型组(P＜0.01)，益肾通络方低剂量组TP较模型组明显升高(P＜0.05)，而ALB较模型组未见明显改善(P＞0.05)。益肾通络方中高剂量组TP、ALB水平与盐酸贝那普利组相当(P＞0.05)，均明显高于益肾通路方低剂量组(P＜0.05)。
正常组、模型组及各治疗组之间AST、ALT、BUN、Scr的水平无明显差异(P＞0.05)。
2.血清TNF-α、IL-6、IL-1β的比较
模型组大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β较正常组明显升高(P＜0.01)，各治疗组TNF-α、IL-6、IL-1β较模型组有不同程度下降(P＜0.01，P＜0.05)。在降低TNF-α、IL-1β方面益肾通络方各剂量组优于盐酸贝那普利；在降低IL-6方面益肾通络方中高剂量组优于盐酸贝那普利，低剂量组与盐酸贝那普利组相当。
3.病理形态改变
正常组大鼠肾小球IgG和补体C3荧光强度为阴性，肾小球结构清晰，肾小管上皮细胞排列有序，肾小球基底膜无增厚，足细胞结构清晰、形态正常、排列有序。模型组大鼠肾小球IgG和补体C3沿肾小球毛细血管袢呈弥漫性沉积，荧光强度为强阳性，肾小球基底膜明显增厚，较多钉突样结构形成，肾小管上皮细胞可见空泡变性，足突广泛融合，足突融合率较正常组明显加重(P＜0.01)。各治疗组大鼠肾脏病理形态较模型组有不同程度改善，足突融合率较模型组有不同程度减轻(P＜0.01，P＜0.05)。
4.细胞凋亡情况
TUNEL法检测细胞凋亡情况，细胞核阳性染色为凋亡细胞。正常组大鼠肾小球足细胞和肾小管上皮细胞未见凋亡。模型组大鼠肾小管上皮细胞和肾小球足细胞可见大量凋亡细胞，肾小管上皮细胞凋亡率明显高于正常组(P＜0.01)，平均每个肾小球切面足细胞凋亡数明显高于正常组(P＜0.01)。盐酸贝那普利组和益肾通络方中高剂量组肾小管上皮细胞凋亡率和每个肾小球切面足细胞凋亡数较模型组明显减少(P＜0.01，P＜0.05)，而益肾通络方低剂量组肾小管上皮细胞凋亡率和每个肾小球切面足细胞凋亡数未见明显减少(P＞0.05)。
WT-1仅表达于足细胞核，是足细胞特异性生物标志，其阳性染色间接反应足细胞数量。正常组大鼠肾小球有较多的WT-1表达；模型组大鼠肾小球WT-1表达较正常组明显减少，足细胞密度显著降低(P＜0.01)；各治疗组大鼠肾小球WT-1表达较模型组有不同程度的增多，益肾通络方中高剂量组和盐酸贝那普利组足细胞密度均明显高于模型组(P＜0.05)，益肾通络方低剂量组足细胞密度未见明显改善(P＞0.05)。
5.肾组织iRhom2、ADAM17、TNF-α、HB-EGF及EGFRmRNA的比较
模型组大鼠iRhom2、ADAM17、TNF-α、HB-EGF及EGFRmRNA表达较正常组明显升高(P＜0.01)。各治疗组iRhom2、TNF-α、HB-EGFmRNA表达均较模型组有明显下降(P＜0.01)；盐酸贝那普利及益肾通络方中高剂量组的ADAM17、EGFRmRNA较模型组明显下降(P＜0.01)，而益肾通络方低剂量组的ADAM17和EGFRmRNA较模型组未见明显下降(P＞0.05)。在降低iRhom2、ADAM17、TNF-α、HB-EGF及EGFRmRNA方面，益肾通络方中高剂量组与盐酸贝那普利组疗效相当(P＞0.05)，均优于益肾通络方低剂量组(P＜0.01，P＜0.05)。
6.肾皮质HB-EGF、p-EGFR蛋白表达的比较
正常组大鼠肾小管少量HB-EGF、p-EGFR表达，肾小球未见HB-EGF表达，仅有少量p-EGFR表达。模型组大鼠HB-EGF和p-EGFR表达较正常组明显增强(P＜0.01)，HB-EGF除在近曲小管表达外，在远曲小管和集合管也有表达；p-EGFR则在肾小管和肾小球都有明显表达。盐酸贝那普利组和益肾通络方中高剂量组的HB-EGF、p-EGFR表达较模型组减少(P＜0.01)；益肾通络方低剂量组的HB-EGF较模型组减弱(P＜0.05)，p-EGFR较模型组未见差异性表达(P＞0.05)。在降低HB-EGF、p-EGFR表达方面益肾通络方中高剂量组与盐酸贝那普利组相当，均优于益肾通络方低剂量组。
7.肾皮质信号通路相关蛋白Rac1、c-jun、c-fos、FasL及凋亡标志蛋白CleavedCaspase-3表达的比较
正常组大鼠肾小球和肾小管间质Rac1少量表达，模型组大鼠Rac1在肾小管间质和肾小球呈明显阳性染色，表达强度明显高于正常组(P＜0.01)。盐酸贝那普利组及益肾通络方中高剂量组Rac1在肾皮质的表达强度较模型组明显减弱(P＜0.01)，益肾通络方低剂量组Rac1的表达量较模型组未见减少(P＞0.05)。
正常组大鼠肾组织c-jun和c-fos仅在肾小管细胞核少量表达。模型组c-jun和c-fos在肾小管细胞核有明显阳性表达，甚至肾小球细胞出现阳性表达，较正常组表达增多(P＜0.01)。盐酸贝那普利及益肾通络方中高剂量组c-jun和c-fos的阳性细胞率较模型组明显减少(P＜0.01)，两者在益肾通络方低剂量组的阳性细胞率较模型组未见差异性减少(P＞0.05)。
正常组大鼠Fasl、CleavedCaspase-3在肾小球和肾小管细胞少量表达。模型组大鼠可见Fasl在肾小管和肾小球细胞的胞膜和胞浆呈强阳性表达，CleavedCaspase-3在肾小球及肾小管细胞的胞质中呈强阳性表达，均较正常组明显增强(P＜0.01)。益肾通络方低剂量组Fasl和CleavedCaspase-3在肾皮质的表达强度较模型组未见明显减弱(P＞0.05)。益肾通络方中高剂量组Fasl、CleavedCaspase-3的阳性表达强度与盐酸贝那普利组相当，均低于益肾通络方低剂量组(P＜0.05)。
结论：
1.以益肾通络法为主治疗MN在提高临床疗效，降低患者24hUTP、TG、Scr，升高TP、ALB以及改善患者临床症状方面较单纯西药治疗效果更加显著，且不良反应发生率较低，安全性更高。提示在MN治疗中当注重益肾通络法的应用，尤其是黄芪、丹参、地龙、炒白术、地黄、当归、僵蚕等中药的应用。
2.自拟组方益肾通络方能明显降低MN大鼠24hUTP，提高血浆蛋白水平，改善脂代谢，减轻肾脏病理损伤，延缓MN进展。其机制可能与调控iRhom2/ADAM17/EGFR信号通路，进而抑制肾脏炎症以及其下游介导的JNK和Fas信号途径的活化，防止足细胞和肾小管上皮细胞凋亡有关。
方法：
第一部分Meta分析
通过计算机检索PubMed、TheCochraneLibrary、EMbase、中国知网、万方数据库、维普中文科技期刊全文数据库和中国生物医学文献数据库等中外文生物医学文献数据库，搜集中医益肾通络法治疗MN的临床随机对照试验，时间从建库至2018年12月。由两名研究员根据纳入和排除标准筛选文献，按照预先设计单独提取数据，交叉核对。用Cochrane偏倚风险评估工具对纳入文献进行偏倚风险评估，用改良后的Jadad量表对纳入文献进行质量评级，用RevMan5.3和Stata15.0进行Meta分析、敏感性分析和发表偏倚评估，系统评价益肾通络法治疗MN的疗效及安全性，并分析益肾通络法治疗MN的用药规律。
第二部分实验研究
健康雄性SD大鼠74只，随机分为正常组12只，造模组62只，造模组通过尾静脉注射C-BSA的方法构建MN大鼠模型。造模结束后随机抽取2只造模大鼠进行肾脏病理检查，证实造模成功。造模成功的大鼠随机分为模型组、盐酸贝那普利组、益肾通络方低、中、高剂量组，并给予相应药物灌胃，正常组、模型组予蒸馏水灌胃。给药4周后，留取相关标本，检测24hUTP、TP、ALB、TC、TG、AST、ALT、BUN、Scr；ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、IL-1β；免疫荧光观察肾小球IgG、C3沉积情况；光镜、电镜下观察大鼠肾脏病理改变；TUNEL法检测肾小球足细胞和肾小管上皮细胞凋亡情况；Real-timePCR检测肾组织信号通路相关分子iRhom2、ADAM17、TNF-α、HB-EGF、EGFR的基因表达；免疫组化检测肾组织足细胞标志蛋白WT-1，信号通路蛋白HB-EGF、p-EGFR，下游JNK和Fas信号通路蛋白Rac1、c-jun、c-fos、Fasl，及凋亡标志蛋白CleavedCaspase-3的表达，并用病理图像分析系统对免疫组化结果进行半定量分析。
结果：
第一部分Meta分析
共纳入17个随机对照临床试验，1238例原发性MN患者，观察组655例，对照组583例。各研究样本含量为40-98例，试验期为2-12个月。Meta分析结果显示：观察组在提高临床疗效[OR=3.22,95%CI(2.30,4.51)，Z=6.81(P＜0.0001)]，减少24小时尿蛋白定量[WMD=-1.15，95%CI(-1.64，-0.65),Z=4.54(P＜0.0001)]，升高血浆白蛋白[WMD=4.62，95%CI(2.76，6.47),Z=4.88(P＜0.0001)]、总蛋白[WMD=3.83，95%CI(0.95，6.71),Z=2.61(P＜0.05)]，改善中医证候积分[SMD=-1.90，95%CI(-2.70，-1.11),Z=4.69(P＜0.0001)]，降低甘油三酯[WMD=-0.22，95%CI(-0.24，-0.20),Z=20.89(P＜0.0001)]及血肌酐[WMD=-5.63，95%CI(-8.98，-2.27),Z=3.28(P=0.001)]方面均优于对照组。但是在降低总胆固醇[WMD=-0.59，95%CI(-1.49，0.30),Z=1.31(P=0.19)]和尿素氮[WMD=-0.91，95%CI(-2.08，0.26),Z=1.52(P=0.13)]方面未显示出明显的优势。
安全性分析：有7项研究统计了患者的不良反应，益肾通络法治疗MN的不良反应发生率[OR=0.41,95%CI(0.23,0.73)，Z=3.04(P＜0.05)]低于单纯西药治疗。
第二部分实验研究
1.生化指标比较
造模结束后，各造模组大鼠24hUTP明显高于正常组(P＜0.01)。治疗结束后，模型组大鼠24hUTP、TC、TG明显高于正常组(P＜0.01)，各治疗组大鼠24hUTP、TC、TG较模型组均明显降低(P＜0.01)；益肾通络方中高剂量组24hUTP、TC、TG水平与盐酸贝那普利组相当(P＞0.05)，均低于益肾通络方低剂量组(P＜0.01)。
治疗结束后，模型组大鼠血清TP、ALB明显低于正常组(P＜0.01)；益肾通络方中高剂量组和盐酸贝那普利组TP、ALB明显高于模型组(P＜0.01)，益肾通络方低剂量组TP较模型组明显升高(P＜0.05)，而ALB较模型组未见明显改善(P＞0.05)。益肾通络方中高剂量组TP、ALB水平与盐酸贝那普利组相当(P＞0.05)，均明显高于益肾通路方低剂量组(P＜0.05)。
正常组、模型组及各治疗组之间AST、ALT、BUN、Scr的水平无明显差异(P＞0.05)。
2.血清TNF-α、IL-6、IL-1β的比较
模型组大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β较正常组明显升高(P＜0.01)，各治疗组TNF-α、IL-6、IL-1β较模型组有不同程度下降(P＜0.01，P＜0.05)。在降低TNF-α、IL-1β方面益肾通络方各剂量组优于盐酸贝那普利；在降低IL-6方面益肾通络方中高剂量组优于盐酸贝那普利，低剂量组与盐酸贝那普利组相当。
3.病理形态改变
正常组大鼠肾小球IgG和补体C3荧光强度为阴性，肾小球结构清晰，肾小管上皮细胞排列有序，肾小球基底膜无增厚，足细胞结构清晰、形态正常、排列有序。模型组大鼠肾小球IgG和补体C3沿肾小球毛细血管袢呈弥漫性沉积，荧光强度为强阳性，肾小球基底膜明显增厚，较多钉突样结构形成，肾小管上皮细胞可见空泡变性，足突广泛融合，足突融合率较正常组明显加重(P＜0.01)。各治疗组大鼠肾脏病理形态较模型组有不同程度改善，足突融合率较模型组有不同程度减轻(P＜0.01，P＜0.05)。
4.细胞凋亡情况
TUNEL法检测细胞凋亡情况，细胞核阳性染色为凋亡细胞。正常组大鼠肾小球足细胞和肾小管上皮细胞未见凋亡。模型组大鼠肾小管上皮细胞和肾小球足细胞可见大量凋亡细胞，肾小管上皮细胞凋亡率明显高于正常组(P＜0.01)，平均每个肾小球切面足细胞凋亡数明显高于正常组(P＜0.01)。盐酸贝那普利组和益肾通络方中高剂量组肾小管上皮细胞凋亡率和每个肾小球切面足细胞凋亡数较模型组明显减少(P＜0.01，P＜0.05)，而益肾通络方低剂量组肾小管上皮细胞凋亡率和每个肾小球切面足细胞凋亡数未见明显减少(P＞0.05)。
WT-1仅表达于足细胞核，是足细胞特异性生物标志，其阳性染色间接反应足细胞数量。正常组大鼠肾小球有较多的WT-1表达；模型组大鼠肾小球WT-1表达较正常组明显减少，足细胞密度显著降低(P＜0.01)；各治疗组大鼠肾小球WT-1表达较模型组有不同程度的增多，益肾通络方中高剂量组和盐酸贝那普利组足细胞密度均明显高于模型组(P＜0.05)，益肾通络方低剂量组足细胞密度未见明显改善(P＞0.05)。
5.肾组织iRhom2、ADAM17、TNF-α、HB-EGF及EGFRmRNA的比较
模型组大鼠iRhom2、ADAM17、TNF-α、HB-EGF及EGFRmRNA表达较正常组明显升高(P＜0.01)。各治疗组iRhom2、TNF-α、HB-EGFmRNA表达均较模型组有明显下降(P＜0.01)；盐酸贝那普利及益肾通络方中高剂量组的ADAM17、EGFRmRNA较模型组明显下降(P＜0.01)，而益肾通络方低剂量组的ADAM17和EGFRmRNA较模型组未见明显下降(P＞0.05)。在降低iRhom2、ADAM17、TNF-α、HB-EGF及EGFRmRNA方面，益肾通络方中高剂量组与盐酸贝那普利组疗效相当(P＞0.05)，均优于益肾通络方低剂量组(P＜0.01，P＜0.05)。
6.肾皮质HB-EGF、p-EGFR蛋白表达的比较
正常组大鼠肾小管少量HB-EGF、p-EGFR表达，肾小球未见HB-EGF表达，仅有少量p-EGFR表达。模型组大鼠HB-EGF和p-EGFR表达较正常组明显增强(P＜0.01)，HB-EGF除在近曲小管表达外，在远曲小管和集合管也有表达；p-EGFR则在肾小管和肾小球都有明显表达。盐酸贝那普利组和益肾通络方中高剂量组的HB-EGF、p-EGFR表达较模型组减少(P＜0.01)；益肾通络方低剂量组的HB-EGF较模型组减弱(P＜0.05)，p-EGFR较模型组未见差异性表达(P＞0.05)。在降低HB-EGF、p-EGFR表达方面益肾通络方中高剂量组与盐酸贝那普利组相当，均优于益肾通络方低剂量组。
7.肾皮质信号通路相关蛋白Rac1、c-jun、c-fos、FasL及凋亡标志蛋白CleavedCaspase-3表达的比较
正常组大鼠肾小球和肾小管间质Rac1少量表达，模型组大鼠Rac1在肾小管间质和肾小球呈明显阳性染色，表达强度明显高于正常组(P＜0.01)。盐酸贝那普利组及益肾通络方中高剂量组Rac1在肾皮质的表达强度较模型组明显减弱(P＜0.01)，益肾通络方低剂量组Rac1的表达量较模型组未见减少(P＞0.05)。
正常组大鼠肾组织c-jun和c-fos仅在肾小管细胞核少量表达。模型组c-jun和c-fos在肾小管细胞核有明显阳性表达，甚至肾小球细胞出现阳性表达，较正常组表达增多(P＜0.01)。盐酸贝那普利及益肾通络方中高剂量组c-jun和c-fos的阳性细胞率较模型组明显减少(P＜0.01)，两者在益肾通络方低剂量组的阳性细胞率较模型组未见差异性减少(P＞0.05)。
正常组大鼠Fasl、CleavedCaspase-3在肾小球和肾小管细胞少量表达。模型组大鼠可见Fasl在肾小管和肾小球细胞的胞膜和胞浆呈强阳性表达，CleavedCaspase-3在肾小球及肾小管细胞的胞质中呈强阳性表达，均较正常组明显增强(P＜0.01)。益肾通络方低剂量组Fasl和CleavedCaspase-3在肾皮质的表达强度较模型组未见明显减弱(P＞0.05)。益肾通络方中高剂量组Fasl、CleavedCaspase-3的阳性表达强度与盐酸贝那普利组相当，均低于益肾通络方低剂量组(P＜0.05)。
结论：
1.以益肾通络法为主治疗MN在提高临床疗效，降低患者24hUTP、TG、Scr，升高TP、ALB以及改善患者临床症状方面较单纯西药治疗效果更加显著，且不良反应发生率较低，安全性更高。提示在MN治疗中当注重益肾通络法的应用，尤其是黄芪、丹参、地龙、炒白术、地黄、当归、僵蚕等中药的应用。
2.自拟组方益肾通络方能明显降低MN大鼠24hUTP，提高血浆蛋白水平，改善脂代谢，减轻肾脏病理损伤，延缓MN进展。其机制可能与调控iRhom2/ADAM17/EGFR信号通路，进而抑制肾脏炎症以及其下游介导的JNK和Fas信号途径的活化，防止足细胞和肾小管上皮细胞凋亡有关。