疟疾仍然是危害人类健康的严重传染病，有效的疫苗将为防止疟原虫感染、减少疟疾发病和阻断蚊媒传播提供重要的手段。DNA疫苗是一种全新的疫苗形式，具有简单、稳定和灵活多样的突出特点，可诱导包括细胞和抗体在内的多种免疫应答。细胞因子在免疫应答过程中具有重要的作用，编码细胞因子的质粒DNA可有效促进和调节DNA疫苗所诱导的免疫应答。用DNA进行初始免疫，用重组蛋白或重组减毒痘病毒进行追加免疫的初始／强化免疫方案可选择性地增强由DNA免疫所诱导的免疫应答，提高DNA疫苗的保护效能。AMA1是红内期疟疾疫苗的重要候选抗原，抗体在针对AMA1的保护性免疫中发挥着关键作用。本研究选择AMA1的胞外域片段作为疫苗靶向，制备了包括重组蛋白、质粒DNA和重组MVA在内的三种不同形式的原型疫苗，在分析各种疫苗免疫特性的基础上，采用DNA加细胞因子编码质粒进行初始免疫，用重组蛋白和重组MVA按不同的顺序进行追加强化，探讨了不同免疫方案在增强小鼠抗AMA1抗体应答中的作用。 首先，自P.f基因组DNA中扩增出编码AMA1胞外域的基因片段，经测序确证后，克隆入原核表达载体。构建了可分别表达AMA1完整胞外域蛋白和不同亚结构域蛋白的系列重组表达载体，包括：pET-16b／E、pET-16b／Ⅰ+Ⅱ、pET-16b／Ⅰ、pET-30a（+）/Ⅱ和pET-30a（+）/Ⅲ。转化E.coli BL21DE3菌，经诱导后表达出各个重组蛋白。用变性剂溶解包涵体蛋白，经Ni-NTA琼脂糖纯化后在适宜的条件下进行重折叠复性。用重组蛋白加福氏佐剂经腹腔接种免疫BALB／c小鼠，制备抗血清，采用免疫荧光和免疫印迹的方法鉴定抗血清的识别特性，用小鼠免疫血清进行疟原虫体外生长抑制实验，分析重组蛋白与保护性抗体应答之间的关系。结果表明，AMA1胞外域蛋白结构的完整性对于保护性抗体的诱导至关重要。 在蛋白免疫实验的基础上，本文选择编码AMA1完整胞外域的基因片段，构建了DNA免疫质粒VR1020／E。用100μg的剂量经肌肉接种BALB／c小鼠，两次免疫后，诱导出明显的AMA1特异的抗体和脾细胞增殖。构建小鼠细胞因子表达质粒pcDNA3／GM-CSF和pcDNA3.1（-）／IL-4，以及双表达质粒pGM-CSF／pTPA-E,用细胞因子表达质粒分别与VR1020／E共同免疫小鼠，分析细胞因子质粒对AMA1 DNA免疫的调节作用。结果表明，各种细胞因子质粒均显著促进了小鼠针对AMA1的抗体和细胞应答，第四军医大学博士学位论文 摘要GM(SF质粒和IL人 质粒分别显著促进了ThZ型和hl型的免疫应答。 MVA是高度减毒的痘苗病毒株，利用重组MVA可诱导针对多种病原体和肿瘤细胞的免疫应答。本文构建了基因转移载体 pllldHR．SSpffi，经同源重组后筛选获得可稳定表达AMAI蛋白的重组病毒dAVVE。用＊～108TCID”剂量的rMVMi经腹腔接种BALB／c ’J’鼠，三次免疫后诱导出明显的抗体和脾细胞应答，其抗体应答以IgGZa为主，表明tMWIN诱导了hl型的免疫应答。 在对三种AMAI原型疫苗的免疫特性进行逐一分析的基础上，本文首先采用h4VA／E对不同质粒DNA免疫组的小鼠进行了追加强化，结果显示，dAVAi可显著增强DNA免疫所诱导的AMA抗体应答，在提高IgG水平的同时，更加显著地促进了小鼠的lgGZa应答。同时发现，DNA初始免疫的应答水平、应答类型以及免疫间隔时间对病毒强化免疫的效果具有一定的影响。初始应答的抗体水平与强化免疫后的抗体水平呈正相关。由GM(SF表达质粒诱导的ThZ型应答在病毒强化后依然占据主导，而由IL－12表达质粒诱导的hl型应答在病毒强化后则得到了进一步的加强和巩固。较长的免疫间隔有利于产生更高水平的回忆性抗体，同时也更加倾向于病毒所诱导的免疫应答即hl型应答。 在进一步的实验中，本文采用 VR1020N加 GM．CSF表达质粒对小鼠进行了初始免疫，而后用重组蛋白和重组MVA按不同的先后顺序进行了组合强化免疫，对比分析不同免疫强化方案在增强小鼠抗体应答中的作用。结果表明，重组蛋白E加福氏完全佐剂和rMVA／E可同样显著地强化DNA诱导的抗体应答，蛋白强化更加显著地促进了IgGI类抗体，病毒强化则更加显著地促进了IgGZa类抗体。重组蛋白E加福氏完全佐剂在fAVAjE强化的基础上进一步提高了小鼠的IgG水平，并显著地增强了IgGZa应答。 以上研究结果为探索以AMAI为应用抗原的红内期疟疾疫苗的最佳免疫方案提供了实验基础。