【摘 要】
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瞬时外向钾电流(Transient outward potassium current,Ito)是一种快激活、快失活的外向钾电流,在啮齿类小动物心脏Ito是动作电位（AP）复极的主要成分,在大型哺乳动物心脏Ito是AP快速复极化1期的电流,影响AP平台期的高度及心脏的兴奋-收缩偶联过程,其功能异常参与Brugada综合征、房颤、心肌肥厚及心衰及家族性特发室颤等疾病的发生,因此,研究其功能调节机制具
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瞬时外向钾电流(Transient outward potassium current,Ito)是一种快激活、快失活的外向钾电流,在啮齿类小动物心脏Ito是动作电位（AP）复极的主要成分,在大型哺乳动物心脏Ito是AP快速复极化1期的电流,影响AP平台期的高度及心脏的兴奋-收缩偶联过程,其功能异常参与Brugada综合征、房颤、心肌肥厚及心衰及家族性特发室颤等疾病的发生,因此,研究其功能调节机制具有十分重要的病理生理意义。负责Ito的通道是由四个Kvα（KV4.3/Kv4.2）亚基组成的跨膜孔区和各种辅助亚单位构成的蛋白复合体,最重要的辅助亚单位包括钾通道相互作用蛋白2（K+channel-interacting protein 2,KCh IP2）和二肽基肽酶样蛋白6（Dipeptidyl peptidase-like protein 6,DPP6）。KCh IP2对Kv4的门控动力学及蛋白表达均具有显著调节作用,小鼠敲除KCh IP2后会造成Kv4表达的大幅减少。既往研究显示DPP6同样可调节Kv4通道动力学,本课题组先前的研究表明DPP6通过转录后调节促进Kv4.3的正向转运,且该作用似乎并不依赖于KCh IP2。为进一步了解成年动物心脏中DPP6在Kv4通道形成中的作用,本研究构建DPP6心肌条件性敲除小鼠,为后续探索DPP6的病理生理意义打下基础。目的:本课题旨在通过DPP6心肌条件性敲除小鼠探索成年小鼠体内DPP6缺失对心脏电生理及功能的影响,分析DPP6在Ito中的生理作用及病理生理意义。方法:1.DPP6心肌条件性敲除小鼠（cKO）的构建委托赛业（苏州）生物科技有限公司通过LoxP-Cre方法构建了DPP6基因的Lox P小鼠。与心脏特异性表达Cre酶的工具鼠（Myh6-Cre ERT）杂交得到Lox P-Cre鼠,成年小鼠腹腔注射他莫昔芬,使Cre酶发挥重组作用,切除目的基因,得到在心肌特异性敲除DPP6基因的小鼠（cKO）,利用q PCR及Western Blot技术检测DPP6基因敲除的效率。2.小鼠的一般状况、心电图及超声心动检测同龄的成年LoxP-Cre（cKO）、Myh6-CreERT（Cre）及野生型（WT）小鼠连续5天腹腔注射40mg/kg剂量的他莫昔芬后,每日观察动物一般状况,于他莫昔芬注射前和最后一次注射之后的5、7、14天分别在异氟烷麻醉状态下进行在体心电图的记录,测量统计包括QT间期、RR间期、PR间期、QRS间期等参数。并利用小动物超声成像系统,在最后一次注射他莫昔芬后的30天时,检测小鼠的心脏左心室收缩和舒张末期的前壁后壁厚度（LVAW;s,LVAW;d,LVPW;s,LVPW;d）、收缩和舒张末期的左心室容积（Volume;s,Volume;d）、内径（Diameter;s,Diameter;d）及其射血分数（EF）、心输出量（CO）等参数。结果:1.cKO鼠的心肌DPP6 mRNA含量与WT组相比有着明显的降低（P＜0.05）;Western Blot显示DPP6条件性基因敲除小鼠的DPP6蛋白表达量与较WT组相比有着明显降低（P＜0.05）。2.在他莫昔芬诱导小鼠Cre酶发挥重组作用后,各组动物包括外观、运动及饮食等一般状况未见异常,但过程中,仅有cKO基因型的小鼠出现无明显征兆的猝死现象,死亡率约为25%,而其他基因型未观察到此现象。3.在体心电图记录发现,cKO小鼠与Cre小鼠在第5天和第7天的心电图波形中都出现了J波下移伴ST段压低现象,并且据测量统计发现第5天和第7天的校正后的QT间期（QTc）延长,但此现象在后续测量中消失。推测此现象的发生是由于Cre酶在他莫昔芬的作用下发挥重组作用时对心脏造成了短时可逆的影响。4.超声心动检测发现,对比左心室收缩和舒张末期的前壁后壁厚度（LVAW;s,LVAW;d,LVPW;s,LVPW;d）、收缩和舒张末期的左心室容积（Volume;s,Volume;d）、内径（Diameter;s,Diameter;d）及其射血分数（EF）、心输出量（CO）等参数,发现各组小鼠之间没有明显的差异（P＞0.05）。结论:本研究成功构建了DPP6心肌条件性敲除小鼠;尽管初步的体表心电图和超声心动检查未发现cKO鼠与同龄的WT、Cre鼠之间有显著差异,但约25%的cKO鼠发生猝死,提示DPP6敲除可能影响心脏的电生理功能,待进一步研究揭示原因。
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