湖北省是我国主要茶叶产区之一,茶树病害种类多,部分病害普遍发生,严重危害茶叶产量和品质。本研究调查了湖北省内茶树叶部病害的发生种类,对茶树病原真菌进行了形态学和分子生物学鉴定,鉴定新病害一种,并开发了一种快速灵敏的茶树病原菌的检测技术。取得的研究结果如下:1本研究于2013年和2014年对湖北省5个茶叶主产区160个茶园的主要茶树叶部病害进行了调查。结果表明,湖北省共发生15种茶树叶部病害,恩施州6种,十堰市10种、宜昌市8种、黄冈市1种、武汉市11种。在所有发现的茶树叶部病害中,发生普遍或危害严重的茶真菌病害主要有茶褐色斑点病、茶云纹叶枯病、茶饼病、茶轮斑病、茶炭疽病、茶褐色叶斑病、茶胴枯病、茶煤病、茶赤叶斑病、茶白星病等9种病害。茶云纹叶枯病和茶炭疽病发生最普遍,在所有5个大区的茶园都有不同程度的发生,其它几种病害在不同地区的发病率高低不等,发病率在0~15.8%。统计显示,湖北省西部恩施州和中部宜昌市的发病程度更低,病情指数为9.3~19.8,西北部十堰市、东部黄冈市和武汉市发病更严重,病情指数为9.9~28.5。这种较高程度的地域相关性可能和当地茶叶质量安全示范区建设有关。在病害调查中发现,茶褐色斑点病是一种新的茶树病害,与茶轮斑病、茶白星病、茶褐色圆星病的典型症状有明显差别。2调查发现,茶叶上存在一种新的褐色斑点病(病斑直径为1~2 mm),但其病原菌尚不明确。从湖北省恩施州宣恩县、十堰市竹溪县、黄冈市英山县、武汉市新洲区等地区采集有褐色斑点病症状的叶片样品,共分离纯化到54个真菌分离物。形态学和内部转录间隔区(Ribosomal internal transcribed spacer,ITS)序列的系统进化分析表明,12个分离物属于拟茎点霉(Phomopsis spp.),8个分离物属于炭疽菌(Colletotrichum spp.),34个分离物属于拟盘多毛孢(Pestalotiopsis spp.)。结合β-微管蛋白(β-tubulin,TUB2)和延伸因子(Translation elongation factor 1-alpha,TEF1)基因序列的系统进化分析结果,34个盘多毛孢菌分离物分别属于茶拟盘多毛孢菌(P.theae)(14个)、山茶拟盘多毛孢菌(P.camelliae)(12个)和棒形拟盘多毛孢菌(P.clavispora)(8个)。对其中7个拟盘多毛孢菌分离物TP1-2O、TP2-1A、TP2-2W、LT3-2O、LT4-1O、LT4-2B和PF2-8O进行了重点分析。采用离体茶叶片进行致病性分析显示,有伤条件下,无论菌丝块或分生孢子悬浮液接种,拟盘多毛孢真菌的接种均可引起褐色小斑点(直径1~2 mm),与田间观察相似,而且茶拟盘多毛孢和棒形拟盘多毛孢致病力比山茶拟盘多毛孢强;在无伤条件下,只有茶拟盘多毛孢具有致病性。茶拟盘多毛孢分生孢子悬液接种田间茶叶,也使叶片表现出了相同的黑点症状,且从发病叶上可以重新分离到该病原,证实茶拟盘多毛孢是褐色斑点病的病原菌。本研究的茶拟盘多毛孢菌(P.theae)分离物如TP1-2O和TP2-2W与茶轮斑病的分离物比较,二者的分生孢子中间细胞颜色、顶端附属丝末端形态、生长速率、致病性等方面有明显差异,在DNA序列的系统进化关系方面也不同。这是第一次报道拟盘孢属真菌可以在嫩茶叶上引起褐色斑点病。3从十堰市竹溪县和武汉市等地采集了具有典型茶云纹叶枯病、茶轮斑病、茶炭疽病和茶胴枯病症状的病叶样品,共分离了5个真菌分离物。根据菌落特征和显微观察结果,分离物ZX3-1、HN-40和HN-1分别属于油茶刺盘孢菌Collectotrichum camelliae、茶拟盘多毛孢菌P.thea和胶孢炭疽菌C.gloeosporioides,另外2个分离物HN-15和HN-42为茎点霉属真菌Phoma spp.。所有分离物的鉴定都严格按照科赫氏法则的分离、致病性测试、再分离和鉴定等步骤进行,这些分离物可能是引起原有症状的相关病原菌。ITS序列或交配型蛋白2(Mating protein2,MAT2)基因序列的分析与形态学鉴定基本一致,证实了这5个分离物的分类地位。本研究首次发现,茶炭疽病原菌胶孢炭疽菌C.gloeosporioides分离物HN-1和茶胴枯病原菌茎点霉菌Phoma spp.分离物HN-15和HN-42对茶树叶片具有一定的致病性,但是否可以在野外直接引起这些病害症状,还需要进一步研究。4针对茶刺盘孢菌C.camelliae、茶拟盘多毛孢菌P.theae和茎点霉菌Phoma spp.设计了3对特异引物和3条Taq Man探针;建立了茶褐色斑点病、茶云纹叶枯、茶轮斑病和茶胴枯病等病害病原菌的实时荧光定量PCR的检测技术。灵敏性分析表明,1~10 pg/μL的纯培养物DNA足以获得强烈的荧光信号,比常规PCR的灵敏性高很多。应用这一技术,成功检测了茶云纹叶枯病原菌油茶刺盘孢菌Colletotrichum camelliae分离物ZX3-1,但不能检测同一真菌属的芒果炭疽病原菌胶孢炭疽菌C.gloeosporioides和草莓炭疽病原菌芳香刺盘孢菌C.fragariae,显示这一套引物和探针具有高度的特异性;,也成功检测了茶褐色斑点病原菌茶拟盘多毛孢菌分离物TP1-2O、TP2-1A和棒形多毛孢菌分离物TP2-2W、茶轮斑病原菌茶拟盘多毛孢菌分离物HN-40,然而这一套引物和探针没有种一级水平的特异性。应用这一技术,成功实现了茶褐色斑点病叶组织中茶拟盘多毛孢菌P.theae的直接检测。这些研究结果将为茶树叶部病害的快速诊断和病原性真菌的快速检测和鉴定奠定了基础。