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随着人类对于基因组的深入研究及认识,越来越多的长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lnc RNAs)被发现,其在肿瘤发生发展中所发挥的作用也不断地被深入研究。本课题组通过前期工作中所做的喉鳞状细胞癌组织芯片结果发现,LINC00886是被筛选出的在肿瘤组织及正常组织中表达差异的lnc RNA,由于食管鳞状细胞癌中突变谱的总体模式与头颈部鳞状细胞癌相似,所以我们推测,在喉鳞癌中差异表达的LINC00886可能也在食管鳞癌的起始及进展中扮演重要角色。本研究检测了LINC00886在食管癌细胞系及食管鳞癌组织中的表达水平及甲基化状态对转录水平的影响;构建过表达质粒探究其对食管癌细胞体外增殖、迁移、侵袭能力的影响,初步分析其对食管癌细胞生物学行为产生影响的作用机制。主要研究内容及结果如下:第一部分长链非编码RNA LINC00886在食管癌细胞及食管鳞癌组织中的表达水平目的:研究长链非编码RNA LINC00886在食管癌细胞系及食管鳞癌组织中的表达,并分析其表达水平与临床病理参数间的关系。方法:1.应用实时荧光定量反转录多聚核苷酸酶链式反应(Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR)的方法检测在4株食管癌细胞系(Eca109、TE1、Kyse150及YES2)中LINC00886的表达情况。2.应用q RT-PCR方法检测在62例食管鳞癌及其相应癌旁正常组织中LINC00886的表达水平,并结合临床病理参数进行分析。3.应用Paris试剂盒分离食管癌细胞系的胞核和胞浆,并应用q RT-PCR方法检测LINC00886在食管癌细胞系中的核浆定位。结果:1.LINC00886在食管癌细胞系中的表达情况:q RT-PCR实验结果显示,LINC00886在4株食管癌细胞系中均呈低表达(P<0.01),且在Eca109及Kyse150细胞中表达最低。2.LINC00886在食管鳞癌组织及相应癌旁正常组织中的表达情况:LINC00886在食管鳞癌组织中表达下调(P<0.01),并与淋巴结转移和TNM分期相关(P<0.05)。3.LINC00886在食管癌细胞系中的亚细胞定位:q RT-PCR结果显示,在Eca109、Kyse150及YES2细胞中,LINC00886主要分布在细胞核,在TE1细胞中,LINC00886主要分布在细胞浆。第二部分长链非编码RNA LINC00886在食管鳞癌中的甲基化状态及对转录活性的影响目的:分析LINC00886启动子区附近Cp G岛在食管癌细胞系及食管鳞癌组织中的甲基化情况,并探讨甲基化对于基因转录活性的影响。方法:1.食管癌细胞系(Eca109、TE1、Kyse150及YES2)应用TSA和5-Aza-d C单独和序贯处理后,采用q RT-PCR的方法检测LINC00886表达水平的变化。2.应用亚硫酸氢盐处理后基因组测序(Bisulfite genomic sequencing,BGS)技术检测Eca109和Kyse150细胞中LINC00886基因组DNA上不同区域Cp G岛的甲基化情况。3.应用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation specific polymerase chain reaction,MSP)的方法检测4株食管癌细胞系(Eca109、TE1、Kyse150及YES2)在5-Aza-d C处理前后、29例食管鳞癌及其相应癌旁正常组织中LINC00886 Cp G岛各区域的甲基化状态。LINC00886的Cp G岛分为三个区域,分别是远端启动子区、近端启动子区和内含子区。4.应用双荧光素酶报告基因实验(Dual-luciferase reporter gene assay)检测LINC00886 Cp G岛各区域的甲基化状态对转录活性的影响。LINC00886共构建三个报告基因载体,区域一为远端启动子区加近端启动子区(p GL3-Region 1),区域二为近端启动子区(p GL3-Region 2),区域三为内含子区(p GL3-Region 3)。结果:1.LINC00886在TSA和5-Aza-d C单独处理和序贯处理前后表达水平的变化:q RT-PCR实验结果表明,除YES2细胞TSA处理组外,Eca109、TE1及Kyse150中LINC00886在TSA、5-Aza-d C单独处理和序贯处理后表达水平均升高(P<0.05或P<0.01)。2.Eca109及Kyse150细胞中LINC00886启动子区附近Cp G岛的甲基化状态:BGS结果表明,Eca109及Kyse150细胞中,LINC00886近端启动子区及内含子区的CG位点呈高甲基化状态,而远端启动子区在Eca109细胞中呈非甲基化,在Kyse150细胞中呈低甲基化状态。3.LINC00886在食管癌细胞系中的甲基化状态:三个区域在5-Aza-d C处理前各细胞系中呈高甲基化状态,在5-Aza-d C处理后近端启动子区和内含子区甲基化程度降低,而远端启动子区,TE1、Kyse150及YES2细胞系的甲基化程度有所降低,但Eca109细胞无明显变化。4.LINC00886在食管鳞癌及相应癌旁正常组织中的甲基化状态:LINC00886近端启动子区及内含子区在食管鳞癌组织中的甲基化率高于相应癌旁正常组织(P<0.01),且与淋巴结转移相关(P<0.05),而远端启动子区,食管鳞癌及相应癌旁正常组织中的甲基化率无明显差异(P>0.05)。5.LINC00886启动子区附近各区域的甲基化状态与其在食管鳞癌组织中表达的关系:近端启动子区的甲基化程度与表达呈负相关(P<0.05),而远端启动子区和内含子区的甲基化状态与表达无明显相关性(P>0.05)。6.LINC00886启动子区附近各区域的甲基化状态对基因转录活性的影响:区域一和区域二的甲基化状态可抑制基因的转录水平,且区域二的抑制效果明显(P<0.01),区域三的甲基化状态对转录水平的影响不显著(P>0.05)。第三部分长链非编码RNA LINC00886的表达水平对食管癌细胞生物学行为的影响目的:研究过表达长链非编码RNA LINC00886后对食管癌细胞生物学行为的影响。方法:1.构建过表达载体pc DNA3.1-LINC00886并转染食管癌细胞Eca109及Kyse150,通过q RT-PCR方法验证过表达效率。2.应用MTS实验及克隆形成实验检测过表达LINC00886后对Eca109及Kyse150细胞体外增殖能力的影响。3.应用划痕实验检测过表达LINC00886后对Eca109及Kyse150细胞体外迁移能力的影响。4.应用Transwell小室侵袭实验检测过表达LINC00886后对Eca109及Kyse150细胞体外侵袭能力的影响。5.应用q RT-PCR方法检测过表达LINC00886后对EMT相关因子(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、Twist、Snail、ZEB1)m RNA表达水平的影响。6.应用Western blot实验检测过表达LINC00886后对EMT相关因子(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin)蛋白表达水平的影响。结果:1.过表达载体pc DNA3.1-LINC00886的构建及转染效率的验证:成功构建过表达载体pc DNA3.1-LINC00886并转染食管癌细胞Eca109及Kyse150,通过q RT-PCR方法验证转染效率发现,过表达组LINC00886的相对表达量显著高于对照组(P<0.01)。2.过表达LINC00886对食管癌细胞体外增殖能力的影响:MTS实验及克隆形成实验结果表明,过表达LINC00886可明显抑制食管癌细胞Eca109及Kyse150的体外增殖能力(P<0.05或P<0.01)。3.过表达LINC00886对食管癌细胞体外迁移能力的影响:划痕实验结果表明,过表达LINC00886可明显抑制食管癌细胞Eca109及Kyse150的体外迁移能力(P<0.05或P<0.01)。4.过表达LINC00886对食管癌细胞体外侵袭能力的影响:Transwell小室侵袭实验结果表明,过表达LINC00886可明显抑制食管癌细胞Eca109及Kyse150的体外侵袭能力(P<0.05或P<0.01)。5.过表达LINC00886对EMT相关因子m RNA表达水平的影响:q RT-PCR结果显示,在Eca109及Kyse150细胞中,过表达LINC00886后,E-cadherin的m RNA表达水平升高(P<0.01),N-cadherin、Vimentin、β-catenin、ZEB1及Kyse150细胞中的Twist和Snail的m RNA表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。6.过表达LINC00886对EMT相关因子蛋白表达水平的影响:Western blot实验结果表明,在Eca109及Kyse150细胞中,过表达LINC00886后,E-cadherin的蛋白表达水平升高,N-cadherin、Vimentin及β-catenin的蛋白表达水平降低(P<0.01)。结论:1.长链非编码RNA LINC00886在食管癌细胞及食管鳞癌组织中低表达,并与淋巴结转移和TNM分期相关,可能参与了食管鳞癌的发生发展过程。2.LINC00886启动子区附近呈现异常高甲基化状态,且近端启动子区的高甲基化可能是导致其沉默的主要机制之一。3.过表达LINC00886可显著减弱食管癌细胞体外的恶性生物学行为,可能是通过调节EMT通路相关因子的表达而影响食管癌细胞的侵袭和转移。