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背景心脏纤维化(cardiac fibrosis)是心肌缺血损伤、心肌肥厚和心力衰竭等绝大多数心脏病理生理状态下共同的主要变化,是心脏重构中最显著的特征性表现。心肌成纤维细胞异常增殖和由其分泌的胶原过渡沉积是心脏纤维化的主要原因。TGF-β1可以有效促进心脏成纤维细胞增殖和胶原分泌,是目前已知的与心肌纤维化的发生关系最密切的生长因子。最新研究显示,micro RNA(miRNA)作为一类新的信号分子,作为TGF-β1的下游分子,发挥促进或抑制心脏纤维化效应。miRNA是一类长度在20～23个核糖核苷酸的单链小分子RNA,作为目前的“明星RNA”,以基因的内源性调节因子身份,参与心脏病理生理过程。目前认为,miRNA与Argonaute蛋白为核心的蛋白复合物组装,成为miRNA功能复合物—RICS(miRNA-induced silencing complex,miRNA 介导的沉默复合物),行使基因调控作用。miRNA主要通过与靶基因mRNA上的miRNA反应元件(miRNA Response Elements,MREs)结合,即miRNA的种子序列(主要是5’端第2-7位核苷酸)识别靶基因上的完全或不完全互补位点,依赖RISC复合物发挥转录抑制、mRNA的切割或降解作用。由于miRNA的转录后调控作用,可以想象它在靶基因的表达上发挥广泛而重要的作用,目前已被证明参与生长发育、增殖分化、应激凋亡等重要生命过程。越来越多的文献支持,miRNA在心脏纤维化过程中发挥着重要调控作用。因此,明确TGF-β1下游miRNA及其调控机制,有助于阐明心脏纤维化的发生发展过程,寻找心脏纤维化的治疗靶点,有着潜在的临床价值。实验目的首先,检测在体或细胞心脏纤维化模型的miR-214-3p水平;其次,构建miR-214-3p条件性敲除小鼠,证明miR-214-3p在体表型;随后,离体水平观测miR-214-3p对细胞增殖能力和成纤维细胞向肌成纤维细胞转化能力的影响;最后,预测并证实miR-214-3p的直接作用靶点,分析靶基因的生物学功能及证实miR-214-3p对于靶点的调控作用。材料与方法(1)qRT-PCR检测在C57BL/6小鼠主动脉横向缩窄(TAC)模型和TGF-β1介导心脏成纤维细胞活化模型中miR-214-3p表达量;(2)利用 miR-214-3pflox/flx/FSP1-cre 小鼠和 miR-214-3pwt/wt/FSP1-cre 小鼠构建小鼠TAC模型。天狼星红染色、qRT-PCR和Western Blot评估各组心脏纤维化水平;(3)通过转染miR-214-3p mimic和inhibitor至心脏成纤维细胞,CCK8实验和EdU实验检测细胞增殖能力,WB和qRT-PCR检测Col1α1和α-SMA的mRNA和蛋白表达。双荧光素酶报告和RIP证实miR-214-3p直接调控NLRC5表达,挽救实验证明miR-214-3p通过调控NLRC5表达发挥抑制心脏纤维化的作用。结果(1)小鼠TAC组心脏miR-214-3p表达水平较小鼠sham组低;利用TGF-β1处理心肌成纤维细胞后,miR-214表达下调;(2)miR-214-3pflox/flox/FSP1-cre sham 处理组与miR-214-3pwt/FSP1-cre sham 处理心脏纤维化水平相当;miR-214-3pflox/flox/FSP1-cre TAC处理组较miR-214-3pwt/wt/FSP1-cre TAC处理组纤维化水平显著加重;(3)上调miR-214-3p促进心脏成纤维细胞的增殖能力和成纤维细胞向肌成纤维细胞转化能力,下调miR-214-3p表达则显示抑制作用;(4)生物信息学预测NLRC5是miR-214-3p的靶基因;(5)下调NLRC5表达抑制心脏成纤维细胞的增殖能力和成纤维细胞向肌成纤维细胞转化能力;(6)miR-214-3p通过抑制NLRC5的表达调控心脏纤维化;(7)双荧光素酶报告系统和RIP技术提示,miR-214-3p和NLRC5 mRNA直接作用,且可能通过NLRC5 CDS区发挥靶基因抑制作用。结论(1)miR-214-3p在体内和体外心脏纤维化模型中表达下调;(2)miR-214-3p在体内心脏成纤维细胞中缺乏会加重TAC致心脏纤维化水平;(3)miR-214-3p抑制心脏成纤维细胞的增殖能力和成纤维细胞向肌成纤维细胞转化能力;(4)miR-214-3p通过抑制NLRC5表达发挥抗心脏纤维化效应。