论文部分内容阅读
背景和目的系统性红斑狼疮(SLE)是一种累及多个系统和器官的全身性自身免疫病,以B细胞过度活化,产生大量自身抗体为特征。治疗SLE主要以糖皮质激素及免疫抑制剂为主,副作用常见。2011年美国FDA批准B细胞活化因子(BAFF)的拮抗剂belimumab用于治疗SLE,使BAFF系统成为研究热点。BAFF系统有三个受体：BR3、TACl、BCMA,其作用并不相同,根据BAFF受体功能的差异,分别阻断或是激活它们可能更有效率,这依赖于对BAFF受体功能的深入了解。所以,对BAFF受体功能的研究,将有助于靶向B细胞治疗SLE的发展。MRL/lpr小鼠是一种SLE的小鼠模型,由于/pr基因发生突变使Fas表达缺陷,造成B细胞不能自然凋亡,过多的B细胞产生大量自身抗体,从而引发SLE。有研究提示BAFF不仅能通过促进B细胞成熟而促进免疫反应,还能通过某些机制抑制免疫,这些机制可能和某些抑制性细胞因子的产生有关。我们实验的目的是研究BAFF对MRL/lpr小鼠脾脏B细胞分泌IL-35有无调控作用并探讨其机制,从而进一步了解BAFF及其受体的功能,为靶向B细胞治疗SLE的发展提供理论依据。方法1.用磁珠分选得到MRL/pr小鼠脾脏B细胞,实验组B细胞加BAFF,对照组B细胞加等体积PBS,培养72小时后用Western blot检测11--35的两个亚基蛋白P35和EBI3的表达,用流式细胞术检测EBI3+P35+B细胞的比例,用ELISA检测上清液中IL-35的浓度,并用培养细胞涂片后作抗EBI3和P35的免疫荧光染色,荧光显微镜下观察并拍摄照片。然后,将MRL/lpr小鼠分设实验组和对照组,分别用中和型BAFF单克隆抗体和等体积PBS进行尾静脉注射,72小时后提取小鼠脾脏,取一部分脾脏用来制做成石蜡切片,进行CDl9、EBI3和P35的免疫荧光染色,在荧光显微镜下观察并拍摄照片。另一部分脾脏除去红细胞后用流式细胞术检测CD19+EBl3+P35+细胞的比例。2.用磁珠分选得到MRL/lpr小鼠脾脏边缘区B(MZ)B细胞和滤泡(FO)B细胞,分别对这两类B细胞进行体外实验。实验组B细胞加BAFF,对照组B细胞加等体积PBS,培养72小时后用流式细胞术检测EBI3+P35+B细胞的比例,用ELISA检测上清液中IL-35的浓度。3.用磁珠分选得到MRL//pr小鼠脾脏B细胞,分为3组进行体外培养,分别加BAFF、BAFF+9B9(989为BR3封闭型单克隆抗体)、PBS,用Western blot检测IL-35的两个亚基蛋白P35和EBI3的表达,用流式细胞术检测EBI3+P35+B细胞的比例。然后,将小鼠脾脏B细胞分为3组,分别加BAFF、ML120B(经典型NF-κB通路的小分子抑制剂)、PBS,用Western blot检测P35和EBI3的表达。所有数据以均数±标准误表示,用t检验比较两组均数的差别,one-way ANOVA比较多组均数,p<0.05被认为差异具有统计学意义。结果1. Western blot显示随BAFF浓度升高,EBI3和P35的表达增强,在BAFF 20 ng/ml时,EBI3和P35表达水平最高,和PBS对照相比,具有统计学差异(p<0.01)。体外试验的流式细胞术结果显示试验组的EBI3+P35+ B细胞比例高于对照组(p<0.05),而体内实验中,流式细胞术结果显示实验组EBI3+P35+ B细胞比例低于对照组(p<0.05)。ELISA试验显示实验组上清液IL-35水平高于对照组(,0<0.05)。2.流式细胞术显示试验组的EBI3+P35+ B细胞比例高于对照组(p<0.05)。ELISA试验显示实验组上清液IL-35水平高于对照组(p<0.05)。3.Western结果显示BAFF组和BAFF+9B9组EBI3和P35表达均高于PBS组(p<0.0S),BAFF组EBI3和P35表达均略高于BAFF+9B9组,但结果均无统计学意义(p>0.05)。随ML120B浓度增加,EBI3和P35表达下降,在ML120浓度为10μM时,EBI3、P35表达显著低于BAFF组(p<0.01)。流式细胞术检测显示BAFF组和BAFF+9B9组EBI3+P35+B细胞比例均高于PBS组(p<0.05),虽然BAFF组EBI3+P35+B细胞比例较BAFF+9B9组略高,但是差异无统计学意义(p>0.05)结论BAFF促进MRL//pr小鼠脾脏B细胞,主要是MZ B细胞分泌IL-35。BAFF受体TACl通过激活经典型NF-κB通路介导这种作用。由于TACI具有抑制免疫作用,单独阻断BR3同时激活TACI治疗SLE可能较单独抑制BAFF更具优势。