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蜂王浆具有许多益于人类健康的生物学功能,蜂王浆主蛋白(MRJPs)作为蜂王浆中含量最多的特征性成分,已经成为当前研究的重点。因此本课题以西方蜜蜂(Apis mellifera)蜂王浆为原料,建立一套逐步分离纯化天然状态下MRJP1-3的流程,并首次利用高灵敏度的高效液相对分离纯化后的单一蛋白进行纯度鉴定,同时研究了蜂王浆蛋白在储存过程中的变化,结果如下。1.使用疏水色谱柱、尺寸排阻色谱柱和阳离子交换色谱柱三种色谱柱,建立了一套MRJP1-3的纯化流程。首先使用Hitrap Butyl-HP疏水色谱柱对蜂王浆粗提液进行分离,得到含有MRJP2和MRJP3的穿透组分,和依次被洗脱的MRJP1寡聚体组分和MRJP1单体组分;然后对两个MRJP1组分分别使用HiLoad X16/60 Superdex 200 pg尺寸排阻色谱柱进行纯化,得到了MRJP1寡聚体1、MRJP1寡聚体2和MRJP1单体;最后使用Toyopearl GigaCap S-650M阳离子交换色谱柱对来自第一步疏水色谱层析的穿透组分进行分离,得到了MRJP2和MRJP3。2.通过高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术对五个纯化好的单一主蛋白进行鉴定,其中MRJP1寡聚体1、MRJP1寡聚体2、MRJP1单体、MRJP2和MRJP3的序列覆盖率分别为:92.13%、76.62%、91.2%、87.39%和64.71%。其中670 kDa蛋白首次被纯化并鉴定为MRJP1寡聚体。使用SEC-HPLC对这五个单一蛋白进行了纯度鉴定,结果分别为89.88%、67.79%、99.92%、99.41%和99.97%。3.利用分析超速离心方法,对MRJP1寡聚体进行精确的分子量测定,结果表明MRJP1含有三个寡聚体,分别是228 kDa的MRJP1寡聚体1、408 kDa的MRJP1寡聚体2和639 kDa的MRJP1寡聚体3,均由MRJP1单体和Apisimin组成。我们推测MRJP1寡聚体2和3分别为MRJP1寡聚体1的二倍体和三倍体。根据中低压尺寸排阻色谱,Native-PAGE电泳和质谱结果,我们发现MRJP1是蜂王浆中含量最多的蛋白,在天然状态下MRJP1在蜂王浆中主要以寡聚体形式存在,228 kDa的MRJP1寡聚体1的含量最多,MRJP1单体的含量很少。4.利用同步辐射真空紫外圆二色谱技术对五个单一主蛋白在25℃下进行二级结构测定,结果表明天然状态下,MRJP1-3主要以β折叠和无规则卷曲组成,α螺旋很少。5.结合电泳分析、蛋白酶解法、茚三酮法、全自动氨基酸分析等技术,确定了蜂王浆蛋白在SEC-HPLC上的9个色谱峰,即峰1主要为MRJP1寡聚体2,峰2主要为MRJP1寡聚体1,峰3主要为MRJP3,峰4主要为MRJP2和少量的MRJP1单体,峰5-9为一些游离氨基酸和小肽。6.使用高效液相尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)分析在不同储存条件下蜂王浆蛋白的变化,结果表明:新鲜蜂王浆在冷冻(-18℃)储存6个月内蛋白成分基本无变化;在4℃下储存1个月后,蛋白成分出现缓慢变化;在室温下储存一个月内,就会出现较为明显的成分变化。在室温和4℃条件下随着储存时间的延长,670 kDa、290 kDa MRJP1寡聚体和MRJP1单体呈现下降趋势,而新出现的700 kDa和440 kDa寡聚体呈现上升趋势。另外,通过SEC-HPLC检测蜂王浆蛋白,发现当蜂王浆中主蛋白峰1面积比小于0.50,峰2面积比大于0.55,峰N面积比小于0.02时,可以认为蜂王浆是新鲜的。因此我们建立了一个基于SEC-HPLC检测蜂王浆蛋白新鲜度的方法。