棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)是世界性重要农业害虫。Bt杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins,ICP)因其对靶标昆虫的高度特异性和对人畜无害,使其相关基因成为目前应用广泛的基因。随着转Bt基因棉花种植面积的快速增长,转入的抗虫基因在棉花体内持续表达,使得棉铃虫在整个生长周期都受到Bt杀虫蛋白的高压选择,存在产生抗性的风险,因此,棉铃虫的抗性问题不容忽视。通过对棉铃虫对Bt产生抗性的机制的研究,可以为棉铃虫的抗性治理提供理论指导,并为棉铃虫的防治提供新的思路。 本论文利用PCR方法分别扩增了对Bt毒素敏感(96-S)和对其具有抗性(Bt-R)的棉铃虫五龄幼虫的中肠氨肽酶N1(Amionpeptidase N,APN1)基因的去信号肽片断,比较了它们的碱基和氨基酸的差异,并成功地将其在昆虫杆状病毒表达系统里进行表达。主要结果如下: 基因克隆与测定结果,鉴定认为棉铃虫APN1是氨肽酶N(APN)基因家族的1个成员,其cDNA序列具有2982个核苷酸,编码产生993个氨基酸的蛋白质。其C端有一段25个氨基酸组成的片段具有亲脂性和跨膜特性。 利用DNAMAN软件比对96-S和Bt-R品系的序列得知:抗性品系有3个碱基缺失,即36-38的ACA缺失,16个碱基发生突变,即579A→T,803C→T,854G→A,1250C→T,1460T→C,1486A→T,1497C→T,1647G→C,2135T→C,2231G→A,2586T→C,2597A→T,2615A→G,2703G→C,2831G→T,2859A→C,导致1个氨基酸缺失,即第45位的苏氨酸缺失,5个氨基酸发生突变,即194苏氨酸→丝氨酸,550缬氨酸→异亮氨酸,861异亮氨酸→苏氨酸,902丙氨酸→脯氨酸,954苏氨酸→脯氨酸。其中194苏氨酸→丝氨酸位于与Bt毒素Cry1Ac结合的活性区,与棉铃虫对Cry1Ac抗性存在潜在的密切关系。861异亮氨酸→苏氨酸,苏氨酸残基提供潜在的新磷酸化位点,用于翻译后修饰,此位点突变会破坏它邻近的半胱氨酸残基形成二硫键能力,打破受体的三级结构,可能导致抗性产生。 将APN1克隆入Bac-to-Bac表达系统中杆状病毒转移载体pFastBacHTb中多角体基因启动子的下游,筛选出重组质粒pFastBacHTb/APN1并转化大肠杆菌DH10Bac,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组载体Bacmid/APN1。转染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni,Tn)细胞(Tn-5B1-4),获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,得到表达的蛋白。SDS-PAGE分析和点杂交显示,目的基因得到了表达。这些结果将为分离、纯化受体蛋白,探索受体蛋白与Bt毒素的相互作用提供基础,为进一步研究抗性机制奠定基础。