甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)系C型凝集素超级家族中胶凝素家族成员，是天然免疫系统中的关键分子。它可选择性识别多种病原体表面的糖结构，以不依赖抗体和C1q的方式激活补体系统，发挥溶破和间接调理功能，还能与吞噬细胞表面胶凝素受体结合而起直接调理作用。人群中MBL基因突变的频率极高，可导致血清MBL水平低下，引起调理吞噬缺损，表现为各种病原体的反复急慢性感染，严重者可致命。目前，MBL的结构-功能关系未明，MBL基因突变引起调理吞噬缺损的机制不清，这些均需进一步研究予以阐明。 MBL由肝细胞合成并分泌入血，但人血浆中MBL含量极低(～1mg／L)，这使得科研和临床应用MBL不但花费高昂而且不可能大规模制备。体外大量制备MBL，将为MBL分子的结构-功能以及MBL基因点突变引起调理吞噬缺损机制等研究提供条件。 一、目的 1．在哺乳动物细胞中表达人MBL基因，获得重组人MBL蛋白。 2．比较重组表达载体PcDNA4／HisC-MBL和PcDNA3.1~+-MBL在哺乳动物细胞CHO、HEPG2和HEK293中的表达情况。 二、方法 1．应用PCR从含有中国人野生型MBL cDNA的质粒pGEM-MBL中扩增目的基因片段，将其克隆至真核表达载体PcDNA4／HisC、PcDNA3.1~+，酶切及测序鉴定。以电穿孔法将重组载体PcDNA4／HisC-MBL转染CHO、HEPG2细胞，将重组载体PcDNA3.1~+-MBL转染CHO、HEPG2和HEK293细胞，Zeocin和G418选择转染子并克隆化培养，以RT-PCR分析mRNA表达。 2.取PcDNA4/HisC一MBL转染的CHO细胞培养上清，通过Ni~NTAagamse柱层析纯化目的蛋白，以SDS一AGE、Westem一blot和ELISA鉴定后，将其免疫小鼠，取鼠抗血清、鼠抗重组CRD血清和甘露聚糖进行ELISA，分析目的蛋白的免疫学和生物学活性。 3.以RT一PCR和ELISA对比分析重组表达载体PcDNA4/HisC一MBL和PcDNA3.l十一MBL在不同细胞中MBL mRNA和蛋白表达情况。 三、结果 1.从pGEM一MBL中扩增得到约750Pb的DNA片段，构建重组载体PcDNA4/HisC一MBL和PcDNA3.1气MBL，经酶切和测序鉴定，结果与预期的完全一致，表明重组表达载体构建成功。采用电穿孔法，将重组表达载体PeDNA4/HisC一MBL和PeDNA3.1气MBL分别转染CHO、HEpGZ和CHO、HEPGZ、HE心93细胞，经选择和克隆化培养，获得一些工程细胞克隆，RT一PCR证实其表达MBL的mRNA。 2，PeoNA4/Hise一MBL转染eHo细胞培养上清，经Ni一NTA agarose柱层析，获得纯化目的蛋白，SDS一AGE分析可见约29KD、58KD和87KD条带，其中29KD蛋白带可与6一Histidine单克隆抗体反应。ELISA检测纯化蛋白能与抗6一Histidine单克隆抗体、鼠抗重组人MBL三聚体CRD血清反应，也可与甘露聚糖有效结合。纯化蛋白免疫小鼠所获抗血清的ELISA效价是1:8 19200，其与天然人MBL和重组人MBL三聚体CRD反应的ELISA效价均为1:25600。 3.RT一PCR和ELISA分析显示，在工程细胞株CHO、HEK293细胞中和细胞培养上清中分别有较高的MBLlnRNA和蛋白表达，而HEPGZ细胞表达较低。 四、结论 1.获得了表达中国人MBL的CHO、HEPGZ、HEK293工程细胞株和具生物学活性的重组人MBL，为MBL分子的进一步研究提供了条件。 2，人MBL在HEK293和cHo细胞中的表达效率较高。