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泡菜起源于中国,经过千年历史的积淀,已成为我国发酵蔬菜的名片。泡菜发酵主要包括自然发酵与强化发酵,是新鲜蔬菜在盐水中经各种微生物协同作用的发酵过程。由于泡菜生产周期长,原料携带较多杂菌,在腌制时会出现大肠杆菌等致病菌的生长现象,引发食品污染、亚硝酸盐过量等问题,同时过量的乳酸菌与酵母菌也会导致泡菜腐败现象。因此,很有必要建立发酵蔬菜中多种微生物的快速检测方法。本文以泡菜为研究对象,采用PMA-qPCR技术对泡菜发酵过程进行微生物群落动态分析,研究了发酵过程中亚硝酸盐的变化机理,并建立了泡菜中大肠杆菌、酵母菌的LAMP检测方法,详细研究内容及结论如下:(1)采用PMA-qPCR技术分析泡菜强化发酵过程中主要微生物的消长规律:发酵初期总乳酸菌、NCU116、酵母菌和大肠杆菌含量迅速上升,发酵中后期总乳酸菌与NCU116含量稳定在10~9CFU/mL,酵母菌缓慢增殖并稳定在10~6CFU/mL,大肠杆菌则迅速消亡;传统活菌计数法耗时长且无法量化目标菌株植物乳杆菌NCU116,PMA-qPCR技术可以快速定量目标菌株,其与传统活菌计数法的检测成果无显著性差别(P>0.05)。PMA-qPCR检测方法为定量检测泡菜发酵期间微生物群落的消长规律提供了一种快速、准确的途径。(2)泡菜发酵期间亚硝酸盐等相关指标的变化:自然发酵和强化发酵过程中,体系pH值都持续走低,其中pH值在泡菜强化发酵期间下降的更快,更早到达发酵终点;泡菜中乳酸菌的含量稳步上升至10~8 CFU/mL,大肠杆菌数量呈现先上升后逐渐消亡的趋势;亚硝酸盐浓度皆在菜蔬腌制前期攀升至“亚硝峰”,随后迅速降低至安全水平,其中强化发酵泡菜的峰值远低于自然发酵泡菜,且其亚硝酸盐浓度更早降低至2.5 mg/kg;NAR、NiR基因的转录水平在发酵1~7 d持续走低,其中自然发酵泡菜NAR基因的转录水平高于强化发酵泡菜,同时乳酸菌能有效胁制大肠杆菌NAR基因的转录,进而减削亚硝酸盐的产生;低pH环境可抑制NiR基因的转录,泡菜强化发酵组的NiR基因转录水平高于自然发酵组,强化发酵进程中亚硝酸盐酶降解的作用高于自然发酵进程。(3)LAMP快检方法的建立:优化了检测体系,设计了大肠杆菌、酵母菌的LAMP检测用引物组,可对大肠杆菌和酵母菌进行特异性识别与检测。本研究对于样品大肠杆菌DNA的检测下限是100 fg/μL,灵敏度超出PCR技术100倍,对样品中酵母菌DNA的最低检测限为100 fg/μL,灵敏度超出PCR技术10倍;对强化发酵及自然发酵泡菜0~7 d样品进行LAMP与常规PCR检测,证实了泡菜强化发酵期间大肠杆菌更早消亡的现象,而常规PCR由于检测灵敏度较低,无法检测到样品中的部分微生物,可能导致漏检现象,相比之下,LAMP快检方法更可靠;LAMP检测结果可通过肉眼观察是否存在白色悬浊或沉淀,或滴加染料SYBR Green I观察是否有黄绿色荧光显现,可用于取样现场的快速检测,也可通过电泳或定量PCR仪进行精确分析。(4)二重LAMP快检方法的建立:优化了二重LAMP快检体系,使原先的引物浓度降低一半,其他物质浓度不变;该方法的最低检测限为100 fg/μL,与单一LAMP检测方法相同;二重LAMP的检测结果可通过熔解曲线法进行鉴别分析,若扩增产物的Tm值在92.7℃左右,说明样品中存在大肠杆菌,若扩增产物的Tm值在93.2℃左右,说明样品中存在酵母菌,若扩增产物的Tm值在92.7~93.2℃之间,说明样品中同时存在大肠杆菌与酵母菌,若未发生扩增反应(无熔解温度峰),表示样品中无大肠杆菌及酵母菌。