论文部分内容阅读
背景及目的:变应性鼻炎（allergic rhinitis,AR）是一种由特定Ig E介导的鼻黏膜慢性炎症性疾病,以鼻塞、流清涕、鼻痒、打喷嚏为主要临床特征。目前AR已成为一种全球性健康问题,但目前临床上针对AR的治疗仍未取得较好的效果。因此深入探讨AR的发病机制,寻找更加有效的治疗方法具有重要意义。MiR-223-3p是一种受多种转录因子调控的多功能micro RNA（miRNA）,具有调节免疫细胞增殖、分化和极化的作用,在炎症中发挥关键作用。嗜酸性粒细胞（eosinophils,EOS）是过敏反应的主要效应细胞,其脱颗粒作用被认为是导致过敏性炎症的重要效应反应。近年来的研究表明,miR-223-3p在AR患者血清中上调,并与血清中EOS数目及其分泌的嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（eosinophil cation protein,ECP）水平密切相关,提示miR-223-3p可能与AR和EOS脱颗粒作用有关,但具体作用机制仍不清楚。泛素连接酶FBXW7能调控多种底物蛋白的降解,并在免疫调节和炎症反应中发挥重要作用。基于我们生物信息学预测到FBXW7是miR-223-3p的靶标,本研究主要聚焦在miR-223-3p和FBXW7在AR中的表达、作用及二者的相关性,并进一步探讨其对AR影响的具体机制。方法:（1）实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-q PCR）和荧光原位杂交检测AR患者、AR小鼠及相应对照组鼻粘膜中miR-223-3p的水平。（2）RT-q PCR检测ECP、嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白（eosinophil major basic protein,MBP）、嗜酸性粒细胞过氧化物酶（eosinophil peroxidase,EPO）在AR患者和小鼠鼻黏膜中的表达。通过改变EOL-1中miR-223-3p的表达,观察卵清蛋白（ovalbumin,OVA）和CCL11刺激后细胞中ECP、MBP、EPO的变化。同时构建小鼠AR模型,并应用miR-223-3p激动剂（miR-223-3p agomir）和miR-223-3p拮抗剂（miR-223-3p antagomir）改变miR-223-3p在体内的表达水平,采用RTq PCR检测小鼠鼻黏膜中miR-223-3p、ECP和MBP的表达,苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色和电镜观察鼻黏膜的形态变化,流式细胞术检测小鼠鼻黏膜和外周血中EOS比例,免疫荧光观察MBP在组织中的表达变化情况,酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠血清中ECP和EPO的分泌情况。（3）从miRTar Base、miRDB、Target Scan、miRmap和DIANA-micro T五个数据库中获取并下载miR-223-3p靶基因,利用在线韦恩图工具取交集后得到较为可信的靶基因,并进行RT-q PCR验证。通过双荧光素酶报告验证miR-223-3p与靶基因的结合后,进一步改变EOL-1细胞中miR-223-3p水平,并采用蛋白免疫印迹反应（western blot）观察靶基因的变化。（4）在过表达miR-223-3p的EOL-1细胞中进一步上调FBXW7的水平,并应用OVA和CCL11进行刺激,通过western blot检测FBXW7的表达,免疫荧光观察细胞中MBP蛋白的表达变化情况。将构建完成的腺相关病毒shFBXW7经鼻腔滴入处理小鼠,应用OVA和氢氧化铝构建小鼠AR模型,同时使用miR-223-3p antagomir抑制miR-223-3p的表达,采用western blot检测小鼠鼻黏膜中FBXW7的表达,HE染色观察鼻黏膜的组织病理形态,免疫荧光观察鼻黏膜中MBP的表达,RT-PCR和ELISA分别检测小鼠鼻黏膜与血清中ECP、EPO的表达水平。结果:（1）与对照组相比,miR-223-3p在AR患者和AR小鼠鼻黏膜中的表达水平升高,且其表达位置主要在胞质。（2）与对照组相比,AR患者和AR小鼠鼻黏膜中ECP、MBP、EPO的m RNA水平均升高。（3）经OVA和CCL11处理后,EOL-1细胞中miR-223-3p、ECP、MBP和EPO的表达水平均升高。上调miR-223-3p的水平促进了经OVA和CCL11处理的EOL-1细胞中ECP、EPO m RNA的表达,而下调miR-223-3p后其表达被抑制。ELISA结果表明,miR-223-3p上调可以促进EOL-1细胞分泌ECP、EPO、MBP,下调miR-223-3p则抑制其分泌。免疫荧光结果显示,经OVA刺激后OVA组的MBP荧光表达量更高,在上调miR-223-3p后进一步增强了MBP的表达,miR-223-3p的降低则减弱了MBP的表达。（4）动物实验HE染色结果显示,采用miR-223-3p agomir上调鼻黏膜中miR-223-3p的表达后加重了鼻黏膜的破坏及EOS的浸润。电镜结果显示,miR-223-3p agomir处理组的鼻粘膜纤毛脱落更为明显、排列更为紊乱,而miR-223-3p antagomir组的鼻黏膜纤毛较整齐,少量出现倒伏。流式细胞术、免疫荧光、RT-q PCR和ELISA的结果则进一步表明,上调miR-223-3p增加了外周血和鼻黏膜中EOS比例,提高了鼻黏膜中ECP、MBP m RNA的表达及血清中ECP、EPO的分泌。（5）通过生物信息学预测,获得IL6ST、FBXW7、FOXO1和NFIA四个靶基因,经过mimics转染及RT-q PCR检测,得出miR-223-3p对FBXW7的抑制作用最为显著。双荧光素酶报告实验结果表明miR-223-3p可以靶向结合FBXW73’UTR。利用miR-223-3p mimics和miR-223-3p inhibitor转染EOL-1细胞后采用western blot进一步验证两者的靶向关系,结果显示过表达miR-223-3p降低了FBXW7蛋白表达水平;而下调miR-223-3p表达则增加FBXW7蛋白的表达水平。RT-q PCR、western blot和免疫组化检测黏膜中FBXW7的结果显示,相较于对照组,FBXW7在AR组鼻黏膜中的表达更低。（6）在过表达miR-223-3p的EOL-1细胞中进一步上调FBXW7的水平,再应用OVA和CCL11进行刺激后,western blot和细胞免疫荧光结果显示,在过表达miR-223-3p的EOL-1细胞中,FBXW7表达水平下调,细胞炎症水平上调;进一步上调FBXW7,miR-223-3p的表达水平依然上调,而FBXW7的表达水平恢复,且细胞的炎症水平下降。（7）在应用干扰病毒的基础上,采用OVA和氢氧化铝构建小鼠AR模型,同时加入miR-223-3p antagomir抑制miR-223-3p的表达。结果发现下调FBXW7后小鼠鼻粘膜上皮肿胀和纤毛破损明显,其间可见大量嗜酸性粒细胞浸润,且增加了小鼠鼻黏膜中ECP、EPOm RNA和MBP表达水平,同时血清中ECP和EPO的分泌也增加;进一步下调miR-223-3p后,可以抑制因FBXW7下调所导致的AR炎症水平升高。结论:MiR-223-3p通过介导FBXW7的表达来调控嗜酸性粒细胞的脱颗粒功能,从而促进AR炎症。MiR-223-3p有望成为AR疾病的治疗靶点,为治疗AR提供新的途径。