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轮状病毒是引起婴幼儿及多种幼龄动物腹泻的主要病原体,其感染是一个多受体介导的、多步骤的复杂过程。刺突蛋白VP4对胰酶敏感,可以被胰酶酶切形成VP8*和VP5*蛋白,进而激活轮状病毒的感染。在轮状病毒的感染过程中,VP8*与VP5*蛋白分离才能够暴露出VP5*蛋白的膜融合区域,进而介导轮状病毒的入胞过程。冰冻电镜的三维重构结果显示:胰酶酶切后,VP8*蛋白仍位于VP5*蛋白的顶端,并通过一段柔性肽与插入基座部分的N端α螺旋相连,维持VP4蛋白结构的稳定性。但是,VP8*与VP5*蛋白相互作用及其在轮状病毒感染过程中的解离机制目前尚不明确。本课题组前期研究中发现,重组表达的羊轮状病毒VP4*蛋白(aa 26-476)免疫小鼠后可以抑制轮状病毒感染导致的排毒和腹泻,并且与天然病毒中的VP4蛋白性质类似,可以被胰酶酶切形成VP8*和VP5*蛋白,为我们研究VP8*和VP5*蛋白之间的相互作用及解离机制奠定了基础。我们首先通过分子对接方法,对轮状病毒VP4蛋白的已有结构进行分析,发现VP8*蛋白在α螺旋之外的区域与VP5*蛋白可能存在相互作用。在此基础上,我们进一步通过蛋白截短和氨基酸定点突变,对VP8*和VP5*蛋白相互作用的关键区域及关键氨基酸进行研究。结果发现,VP8*与VP5*蛋白相互作用的关键氨基酸包括P37、T43、Y45、Y69、S257、G286、V474和P475。综合分子对接方法、蛋白截短和定点突变的结果发现,VP8*和VP5*蛋白之间主要通过氢键和疏水相互作用维持VP4蛋白结构的稳定性。在解离机制方面,我们研究了受体结合、pH以及内吞小泡内蛋白酶对VP8*和VP5*蛋白相互作用的影响。结果发现,不同毒株VP8*和VP5*蛋白的解离机制存在一定的差异,对于SA11和DS-1毒株,受体结合可以导致VP8*和VP5*蛋白的解离,酸化可导致LLR和DS-1毒株VP8*和VP5*蛋白的解离,而内吞小泡内蛋白酶的影响则较小。此外,受体和pH在LLR和DS-1毒株VP8*和VP5*蛋白的解离中具有协同效果。我们推测不同毒株解离机制的差异可能与其在内吞小泡的不同阶段释放到胞质有关。综上所述,本研究初步研究了轮状病毒VP8*和VP5*蛋白相互作用的机制及其在轮状病毒感染过程中的解离机制,为阐明轮状病毒感染机制奠定了基础,也可以为研制新型的轮状病毒疫苗提供一定的依据。