目的:　　通过构建80 bp的单链DNA(Single strand DNA，ssDNA)随机文库，采用指数富集配体进化（ Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）技术筛选与艰难梭菌毒素 A和 B结合率和亲和力强的适配体，为建立快速、准确诊断艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection, CDI)提供新的实验室诊断方法。　　方法:　　一、pET-28b-tcdA-C与 pET-28b-tcdB-N原核表达载体的构建及重组蛋白毒素A和B的表达和纯化　　（1）分别设计特异性引物，用 PCR技术分别扩增出毒素 A羧基末端（C7158-8130）和毒素B氨基末端(N1-1629)基因片段。　　（2）PCR扩增产物和pMDTM19-T分别进行DNA内切酶酶切反应，回收酶切毒素A羧基末端和毒素B氨基末端基因片段与pMDTM19-T载体相连，转化入大肠杆菌（Escherichiacoli,E coli）DH5α中，涂布于氨苄青霉素抗性平板筛选出阳性克隆菌落。　　（3）经测序正确后分别提取并双酶切 pMDTM19-T-tcdA-C与pMDTM19-T-tcdB-N重组质粒，进行琼脂糖凝胶电泳回收tcdA-C和tcdB-N基因片段，构建 pET-28b-tcdA-C与 pET-28b-tcdB-N原核表达载体，转化到 E.coli BL21(DE3)。　　（4）E.coli BL21(DE3)培养至OD600约为0.6时，调整IPTG终浓度分别为0.3、0.6、0.8、1.0、1.5mmol/L，诱导表达时间分别为2、4、6、8、10h，诱导表达温度分别为25、30、37℃，选择最适的表达条件，采用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的重组蛋白，利用BCA蛋白定量试剂盒测定纯化蛋白的浓度并对重组蛋白毒素A和B进行Western-blot鉴定。　　二、随机文库的构建以及重组蛋白毒素A和B适配体的筛选　　（1）设计合成全长为80bp的ssDNA随机文库，两端为20个碱基的固定序列，以便设计相应引物用于文库扩增，中间40个碱基为随机序列，构建ssDNA的文库容量达到440。　　（2）分别以重组蛋白毒素 A和 B为靶分子，将蛋白分别包被于96孔板上，同时设立空白对照孔，经反筛后将未与空白对照孔结合的ssDNA分别放入包被有重组蛋白毒素A和B的板孔中孵育，洗涤弃去未与靶蛋白结合的ssDNA，然后洗脱与靶蛋白结合的ssDNA，用上游引物和5’端标记有生物素的下游引物进行PCR反应，将ssDNA扩增为dsDNA，此时非文库链的5’端即可标记上生物素；　　（3）将上述步骤所得的PCR产物和链霉亲和素磁珠混合，PCR产物通过生物素与磁珠上的亲和素结合，加入适量的碱性溶液，使dsDNA解链成ssDNA，5’端标记有生物素的非文库链仍然与磁珠相连，而文库链游离在溶液中，利用磁力架吸引磁珠分离并获得次级ssDNA候选库。　　（4）将次级ssDNA候选文库再分别与毒素A和B温育，进入第二轮筛选。如此循环，随着筛选轮数的不断增加，亲和力低的ssDNA逐渐被淘汰。经过大约6-13轮筛选后，分别与重组毒素A和B结合力强的适配体得到富集。各轮筛选完毕，每一轮筛选后收集的ssDNA文库量与相应轮数反筛后的ssDNA文库量的比值，即得到每轮结合反应的结合率，结合率达到稳定后，停止筛选。　　（5）利用正常上下游引物扩增结合率稳定的筛选文库，纯化 PCR产物并进行克隆测序，分析测序所得ssDNA序列和二级结构，分别找到与重组蛋白毒素A和B结合较理想的ssDNA作为毒素A和B的适配体。　　（6）根据非竞争性 ELISA法检测筛选富集的适配体与重组蛋白的亲和常数。　　结果:　　（1）分别成功扩增出艰难梭菌毒素 A羧基末端和毒素 B氨基末端976bp和1629 bp基因序列，将其与pMDTM19-T载体相连，测序无基因突变。　　（2）双酶切重组质粒后分别回收 tcdA-C和 tcdB-N基因片段，成功构建了pET-28b-tcdA-C、pET-28b-tcdB-N原核表达载体。　　（3）经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳分析可知，在诱导菌液上清液中分别出现蛋白分子量约为35KDa、60KDa的目的蛋白，与预期值相符。　　（4）经Ni-NTA亲和柱纯化后，SDS-PAGE电泳结果显示，重组蛋白毒素A和B得到了较好的纯化，测定重组蛋白毒素A和B的浓度分别为138μg/ml与55ug/ml，Western blot检测证明重组毒素A和B能够很好的与艰难梭菌毒素A和B相对应的单克隆抗体结合。　　（5）以重组蛋白毒素A和B为靶标，采用SELEX技术进行适配体的筛选，随着筛选轮数的不断增加，随机ssDNA文库分别与重组蛋白毒素A和B的结合率分别从1.4％增加到44.6%和从0.8%增加到39.6%，且在第10、11、12轮的结合率增加幅度均不明显，表示结合率趋于稳定，停止筛选。　　（6）选择第12轮筛选后的文库进行克隆测序，经一级结构和二级结构的分析，重组蛋白毒素A筛选的适配体出现了6组完全相同的序列，重组蛋白毒素B筛选的适配体出现了4组完全相同的序列，分别选择Apt-A22和Apt-B20两条适配体进行后续的亲和常数的检测。　　（7）利用非竞争ELISA法测定重组蛋白毒素A与适配体Apt-A22的亲和常数值为22.47×106 M-1；重组蛋白毒素 B与适配体 Apt-B20的亲和常数值为37.64×106 M-1。　　结论:　　成功构建了艰难梭菌毒素A和毒素B的pET-28b-tcdA-C和pET-28b-tcdB-N原核表达载体，并诱导表达获得纯化的重组蛋白毒素A和毒素B；利用两种重组蛋白，采用SELEX技术筛选，成功获得6组序列相同的毒素A适配体和5组序列相同的毒素B适配体。