【摘 要】
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研究背景顺铂是晚期膀胱癌最常用的化疗药物之一。以往人们认为顺铂对包括膀胱癌在内肿瘤细胞的杀伤作用主要依赖其对DNA结构的不可逆损伤作用。近来有研究发现顺铂除了能通过DNA损伤作用直接杀伤肿瘤细胞外,还可以调控肿瘤微环境中的免疫组分来发挥抗肿瘤免疫效应,但其具体机制和作用仍不明确。因此探讨膀胱癌顺铂治疗免疫效应,有助于我们深入理解顺铂的综合作用机制。研究目的1.探讨顺铂相关免疫效应与膀胱癌内源性c
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研究背景顺铂是晚期膀胱癌最常用的化疗药物之一。以往人们认为顺铂对包括膀胱癌在内肿瘤细胞的杀伤作用主要依赖其对DNA结构的不可逆损伤作用。近来有研究发现顺铂除了能通过DNA损伤作用直接杀伤肿瘤细胞外,还可以调控肿瘤微环境中的免疫组分来发挥抗肿瘤免疫效应,但其具体机制和作用仍不明确。因此探讨膀胱癌顺铂治疗免疫效应,有助于我们深入理解顺铂的综合作用机制。研究目的1.探讨顺铂相关免疫效应与膀胱癌内源性c GAS-STING通路激活的相关性及其调控机制2.探索顺铂诱导的膀胱癌内源性c GAS-STING信号激活对膀胱癌增殖的影响及其机制研究方法1.我们首先通过RNA转录组测序联合生物信息学分析发现,顺铂处理激活了T24膀胱癌细胞系中多种免疫炎症相关通路,且这些免疫炎症通路的激活可能与c GAS-STING信号的激活相关。结合公共数据库我们探索了STING蛋白在膀胱癌中的基础表达水平。通过实时荧光定量PCR,蛋白印迹实验,酶联免疫吸附实验,报告基因实验,免疫荧光以及流式细胞分析技术等来验证了顺铂处理后膀胱癌细胞系中c GAS-STING通路及其下游信号是否激活。通过小干扰沉默STING或使用STING特异抑制剂H151来验证T24、TCCSUP膀胱癌细胞系顺铂相关的免疫效应是否显著减弱。2.结合公共数据库探索膀胱癌中STING激活上游蛋白c GAS的基础表达水平。通过免疫荧光,亚细胞组分蛋白印迹试验探索顺铂处理后膀胱癌细胞系的DNA损伤修复状态;探索顺铂处理后膀胱癌细胞系中c GAS的总体表达水平,细胞定位以及染色质绑定c GAS蛋白水平是否改变。3.使用CCK-8试验以及克隆形成试验探索STING蛋白敲低后膀胱癌细胞系的体外增殖水平是否改变。结合TCGA数据库分析c GAS-STING中关键蛋白的中位数表达水平是否与患者的整体生存以及无病生存相关。4.使用慢病毒转染构建STING-Knockdown及STING-WT稳转MB49小鼠来源膀胱癌细胞株。在C57BL/6J小鼠中构建MB49膀胱癌皮下移植模型,比较PBS联合STING-Knockdown组,PBS联合STING-WT组,顺铂联合STING-Knockdown组,顺铂联合STING-WT组小鼠皮下瘤增殖情况,并通过流式细胞技术分析CD3+CD45+,CD8+CD45+,CD11c+MHCII+以及F4/80+CD11b+免疫细胞浸润比例。结合上述结果分析顺铂相关STING信号激活对小鼠膀胱癌皮下移植瘤增殖的影响及其可能机制。最后使用CIBERSORT分析TCGA数据库中接受过膀胱癌顺铂化疗患者的预后与肿瘤微环境免疫细胞浸润水平的相关性。研究结果1.顺铂诱导膀胱癌细胞产生免疫效应,主要体现为I型干扰素分泌等免疫通路的富集以及包括IL-6,INF-β等细胞因子、趋化因子分泌显著增加,这种免疫效应和c GAS-STING通路的激活密切相关。顺铂诱导的T24、TCCSUP膀胱癌细胞系中ds DNA累积以及染色质绑定c GAS蛋白的释放可能是激活c GAS-STING信号并导致下游特殊免疫效应的重要原因。2.沉默或抑制STING不影响T24、TCCSUP膀胱癌细胞系体外增殖水平。在C57BL/6J小鼠皮下移植瘤实验中,顺铂激活的膀胱癌细胞内源性c GAS-STING信号抑制了的小鼠膀胱癌皮下瘤的增殖。同时膀胱癌内源性c GAS-STING信号的激活诱导了小鼠膀胱癌皮下瘤免疫微环境浸润性CD11c+MHCII+和CD8+CD45+细胞增加。研究结论顺铂可通过诱导DNA损伤以及促进染色质绑定c GAS蛋白释放等方式激活膀胱癌内源性c GAS-STING信号。顺铂诱导的膀胱癌内源性c GAS-STING信号的激活促进了包括IL-6,INF-β在内的细胞因子分泌,并诱导了小鼠膀胱癌皮下瘤肿瘤微环境中浸润性CD11c+MHCII+和CD8+CD45+细胞增加。这些结果将为晚期膀胱癌治疗中顺铂联合免疫疗法的尝试提供新的思路。
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