碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE）在全球范围内的传播与流行现象日益严峻,我国临床分离率亦逐年提升,其中碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP）所占比例最为显著。而CRE感染治疗时常面临有效治疗药物局限及患者预后不佳等困境。在危重症患者中,CRKP肠道定植患者表现出更高的感染死亡风险。部分国家地区已将CRE定植筛查纳入院感监测项目,优先筛查直肠拭子及粪便。明确我国住院患者CRE肠道定植现状及碳青霉烯酶型分布,进一步阐明重症患者CRKP定植与继发感染的相关性以及感染治疗过程中CRKP体内耐药进化机制,这对有效制定感控措施,合理指导抗菌药物使用及改善继发感染患者预后有着重要价值。第一部分选取2018年5月9日至2019年5月2日期间中国4所三甲医院2404例住院患者的双头直肠拭子标本,将一头拭子用于碳青霉烯耐药菌分离培养,另一头进行碳青霉烯酶基因型试剂盒检测,明确了我国住院患者CRE定植现状并验证快诊试剂盒性能。进一步选取菌株通过药敏检测、PCR、全基因组测序以及生物信息学分析等方法,明确杭州地区重症患者CRE定植菌株的耐药现状及机制。结果显示:住院患者的CRE定植率为10.1%（244/2404）。ICU患者作为主要筛查对象,CRE定植率为11.5%（172/1500）,菌株中产碳青霉烯酶的比例为85.9%（240/256）,其中产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌最多（62.5%,150/240）,其次是产NDM型碳青霉烯酶大肠埃希菌（11.3%,27/240）。在杭州三甲医院ICU分离的78株CRE菌株中,多黏菌素的耐药率最低,为9.0%;ST11型CRKP菌株具克隆优势（76.8%,43/56）;KPC-2是主要碳青霉烯酶（82.1%,55/67）;11株不产酶CRE菌株具Amp C酶或/和ESBL酶基因,提示碳青霉烯耐药相关。大部分替加环素耐药菌株具外排泵Acr AB及调控因子点突变;除固有耐药外,多黏菌素耐药菌株携带双组分调控系统Pmr AB及Pho PQ相关点突变或质粒介导mcr-1.1基因;大部分头孢他啶/阿维巴坦耐药菌株携带金属酶。此外,Xpert Carba-R试剂盒与参比方案具临床等效性,可实现样本酶型快速诊断。第二部分选取2017年6至10月杭州一所三甲医院258名危重症患者818例直肠/鼻咽拭子进行CRKP筛查,通过药敏检测、PFGE分型、定植随访观察等方法,了解该中心重症患者CRKP定植情况及耐药率,明确定植患者继发感染危险因素,阐明定植与感染相关性。结果显示:CRKP分离率为22.6%（185/818）,多黏菌素耐药率最低（2.2%,4/185）;重症患者CRKP定植率为31%（80/258）,肠道定植比例为72.5%（58/80）。53例携带者（筛前半年无感染史）中,16例在随访期发生感染,且同一患者感染与定植CRKP菌株具高度同源性,大部分患者菌株属同一PFGE簇,提示CRKP定植与感染密切联系,以及重症病房内可能存在同一克隆播散流行。定植患者继发感染的高危因素不明,需重视所有重症患者的定植情况。第三部主要研究了CRKP菌株在多种抗菌药物暴露下的体内耐药进化机制。研究选取一名感染患者多种感染部位分离11株CRKP菌株,通过表型检测、PCR、PFGE、核酸杂交免疫印迹、全基因组测序及分析明确了CRKP系列菌株特征及差异,通过野生型目的基因回补试验明确了突变位点与替加环素及多黏菌素敏感性变化的相关性,最后推导了体内抗生素压力下CRKP耐药进化策略。结果显示:CRKP菌株均属ST11-KL64型,菌株间同源性较高,且bla KPC-2基因均在约100kb质粒上;7株表型高黏,4株多黏菌素耐药,3株替加环素耐药。菌株基因组存在多种耐药与毒力因子,分布于1个毒力质粒和2个耐药质粒。回补实验证实了替加环素耐药与lon移码突变相关,多黏菌素耐药与pmr B、pho Q和mgr B位点突变相关。综上,ST11-KL64型CRKP在替加环素及多黏菌素治疗中,可通过染色体多种突变途径进化为耐药菌株,并引起人体多部位侵袭性感染及持续的肠道定植。