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增龄导致的女性生殖能力下降以及胎儿染色体异常的增加是目前困扰女性生殖健康的最大挑战。女性生育力下降与卵巢储备及卵细胞质量的下降密切相关。在女婴刚出生时，其卵巢中卵细胞数量接近100万枚左右，但是在女性一生中，仅仅只有约500枚卵细胞排出，这只占卵巢中卵细胞总数的0.1%，而剩下的约99.9%卵细胞是白白损耗掉，并且这种损耗的机制尚不明确。卵泡池损耗从女婴约1-3岁开始直到女性约51-52岁卵巢储备耗竭为止，是一种非线性的加速过程。如果我们能找到在女性生殖后期卵泡池加速耗竭的原因，然后靶向治疗，就能实现改善增龄女性生殖能力以及推迟更年期的目的。数学建模计算得出，如果能让卵泡池耗竭减速，更年期能够被推迟到约71岁。
在哺乳动物卵细胞中，同源重组修复在保护卵巢内卵细胞的数量和质量上起着重要作用。已有大量的研究表明，GV(Germinal Vesicle)期卵细胞中DNA双链断裂修复(Double Strand Breaks Repair,DSBR)缺陷是增龄导致卵巢储备耗竭的原因。同源重组发生在初级卵母细胞第一次减速分裂细线期，终止于双线期。此后卵细胞在卵巢中停留数十年，直至接受激素刺激，获得受精能力。在这漫长的数十年中，卵细胞要经历来自体内和体外的不良环境刺激。修复DNA损伤的能力对于维持卵巢中卵细胞数量是至关重要的。因此，如果卵细胞不能应对DNA损伤，它将导致胚胎染色体异常并将缺陷遗传给下一代。
不同于先前大量研究聚焦在DNADSBR参与卵巢储备维持上，休眠期的卵细胞已处于双线期，此时已完成同源重组。此外，也有研究报道碱基切除修复(Base Excision Repair, BER)缺陷参与年龄相关的疾病发生。我们推测BER可能参与到卵巢老化的进程中。为此，我们将实验设计为三个部分(年龄与卵巢储备的因果关系、年龄与BER的因果关系、BER与卵巢储备的因果关系)以验证我们的假设。
目的：第一部分：为了探究增龄与卵巢储备下降的因果关系，采用HE(Hematoxylin Eosin staining)染色方法观察年轻组与增龄组C57BL/6J雌鼠卵巢储备的情况，探索在卵巢生理性衰老过程中，是否存在卵细胞数量减少的现象，探索年龄是否影响卵巢储备；
第二部分：为了探究增龄与BER的因果关系，本课题检测了年轻和增龄C57BL/6J雌鼠卵细胞的DNA损伤情况，采用碱性彗星实验、AnnexinⅤFITC/PI细胞凋亡检测比较年轻和增龄雌鼠卵细胞凋亡及DNA损伤情况，同时检测了年轻和增龄卵细胞在体内和体外的BER修复效率、BER关键基因在蛋白水平、mRNA水平变化，探索年龄是否影响DNA损伤修复；
第三部分：为了探究BER与卵巢储备的因果关系，本课题构建BER关键基因DNA聚合酶β(DNAPolymerasebeta,Polβ)knockdown及knockin小鼠，检测它们相应卵巢储备指标，同时分别对年轻小鼠卵细胞siRNA干扰，对增龄小鼠卵细胞过表达Polβ基因，检测卵细胞存活情况，探索调控DNA损伤修复是否影响卵巢储备。
方法：第一部分选取6-8周龄、8月龄C57BL/6J雌鼠，比较两组间小鼠卵巢储备情况(卵细胞数量)；第二部分选取6-8周龄、8月龄C57BL/6J雌鼠，获取卵细胞，采用AnnexinⅤFITC/PI和碱性彗星实验检测卵细胞凋亡和DNA损伤的情况;同时在两组小鼠体内注射8-羟鸟嘌呤(8-OH-dGTP，8-OHdG)，检测8-OHdG修复情况；另外，取两组小鼠卵细胞裂解液进行BER体外修复实验，以检测体外卵细胞的BER修复效率;同时采用免疫荧光(Immunofluorescence, If)和实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR, QPCR)检测BER相关基因的表达变化。第三部分调控BER关键基因来检验卵巢储备变化。对年轻小鼠卵细胞siRNA敲降、Knockdown小鼠及knockin小鼠验证BER关键基因缺陷对卵巢储备的影响；同时在增龄小鼠卵细胞过表达关键基因，检测是否能够抵抗不良环境影响。
结果：我们发现随着年龄增加，卵巢内卵细胞数量显著减少；卵细胞凋亡数量显著增加；卵细胞内DNA单链损伤显著增加(碱性彗星实验拖尾增加、AP位点数量显著增加)；卵细胞碱基切除修复效率下降(体内、体外实验)。同时，我们通过免疫荧光实验和QPCR实验结果发现增龄导致卵细胞碱基切除修复效率下降是由于BER重要基因Polβ表达量和活性下降所致。我们采用siRNA干扰年轻小鼠卵细胞Polβ基因表达量，发现小鼠卵细胞凋亡显著增加；同时我们在增龄卵细胞中过表达Polβ基因表达量，发现小鼠卵细胞抵御外界不良环境刺激能力显著增强。此外，我们在Polβknockout杂合小鼠模型上，再次观察到年轻小鼠表型为卵巢储备下降。在Polβknockin小鼠模型上，观察到年轻小鼠卵巢老化的现象。
上述的研究结果表明BER通路参与卵巢储备的维持并发挥重要作用。此外，我们发现年龄导致卵细胞Polβ基因表达量和活性下降，这与小鼠卵巢老化密切相关。Polβ在BER中发挥重要作用，Polβ缺陷会导致BER效率下降，使细胞无法及时修复DNA损伤，造成DNA损伤累积，最终导致细胞凋亡发生。我们通过对增龄卵细胞内过表达Polβ来抵御卵细胞应对外界不良环境刺激的能力，实现延缓卵巢老化的进程。
结论：Polβ介导的BER效率的下降是卵巢老化的原因之一。
在哺乳动物卵细胞中，同源重组修复在保护卵巢内卵细胞的数量和质量上起着重要作用。已有大量的研究表明，GV(Germinal Vesicle)期卵细胞中DNA双链断裂修复(Double Strand Breaks Repair,DSBR)缺陷是增龄导致卵巢储备耗竭的原因。同源重组发生在初级卵母细胞第一次减速分裂细线期，终止于双线期。此后卵细胞在卵巢中停留数十年，直至接受激素刺激，获得受精能力。在这漫长的数十年中，卵细胞要经历来自体内和体外的不良环境刺激。修复DNA损伤的能力对于维持卵巢中卵细胞数量是至关重要的。因此，如果卵细胞不能应对DNA损伤，它将导致胚胎染色体异常并将缺陷遗传给下一代。
不同于先前大量研究聚焦在DNADSBR参与卵巢储备维持上，休眠期的卵细胞已处于双线期，此时已完成同源重组。此外，也有研究报道碱基切除修复(Base Excision Repair, BER)缺陷参与年龄相关的疾病发生。我们推测BER可能参与到卵巢老化的进程中。为此，我们将实验设计为三个部分(年龄与卵巢储备的因果关系、年龄与BER的因果关系、BER与卵巢储备的因果关系)以验证我们的假设。
目的：第一部分：为了探究增龄与卵巢储备下降的因果关系，采用HE(Hematoxylin Eosin staining)染色方法观察年轻组与增龄组C57BL/6J雌鼠卵巢储备的情况，探索在卵巢生理性衰老过程中，是否存在卵细胞数量减少的现象，探索年龄是否影响卵巢储备；
第二部分：为了探究增龄与BER的因果关系，本课题检测了年轻和增龄C57BL/6J雌鼠卵细胞的DNA损伤情况，采用碱性彗星实验、AnnexinⅤFITC/PI细胞凋亡检测比较年轻和增龄雌鼠卵细胞凋亡及DNA损伤情况，同时检测了年轻和增龄卵细胞在体内和体外的BER修复效率、BER关键基因在蛋白水平、mRNA水平变化，探索年龄是否影响DNA损伤修复；
第三部分：为了探究BER与卵巢储备的因果关系，本课题构建BER关键基因DNA聚合酶β(DNAPolymerasebeta,Polβ)knockdown及knockin小鼠，检测它们相应卵巢储备指标，同时分别对年轻小鼠卵细胞siRNA干扰，对增龄小鼠卵细胞过表达Polβ基因，检测卵细胞存活情况，探索调控DNA损伤修复是否影响卵巢储备。
方法：第一部分选取6-8周龄、8月龄C57BL/6J雌鼠，比较两组间小鼠卵巢储备情况(卵细胞数量)；第二部分选取6-8周龄、8月龄C57BL/6J雌鼠，获取卵细胞，采用AnnexinⅤFITC/PI和碱性彗星实验检测卵细胞凋亡和DNA损伤的情况;同时在两组小鼠体内注射8-羟鸟嘌呤(8-OH-dGTP，8-OHdG)，检测8-OHdG修复情况；另外，取两组小鼠卵细胞裂解液进行BER体外修复实验，以检测体外卵细胞的BER修复效率;同时采用免疫荧光(Immunofluorescence, If)和实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR, QPCR)检测BER相关基因的表达变化。第三部分调控BER关键基因来检验卵巢储备变化。对年轻小鼠卵细胞siRNA敲降、Knockdown小鼠及knockin小鼠验证BER关键基因缺陷对卵巢储备的影响；同时在增龄小鼠卵细胞过表达关键基因，检测是否能够抵抗不良环境影响。
结果：我们发现随着年龄增加，卵巢内卵细胞数量显著减少；卵细胞凋亡数量显著增加；卵细胞内DNA单链损伤显著增加(碱性彗星实验拖尾增加、AP位点数量显著增加)；卵细胞碱基切除修复效率下降(体内、体外实验)。同时，我们通过免疫荧光实验和QPCR实验结果发现增龄导致卵细胞碱基切除修复效率下降是由于BER重要基因Polβ表达量和活性下降所致。我们采用siRNA干扰年轻小鼠卵细胞Polβ基因表达量，发现小鼠卵细胞凋亡显著增加；同时我们在增龄卵细胞中过表达Polβ基因表达量，发现小鼠卵细胞抵御外界不良环境刺激能力显著增强。此外，我们在Polβknockout杂合小鼠模型上，再次观察到年轻小鼠表型为卵巢储备下降。在Polβknockin小鼠模型上，观察到年轻小鼠卵巢老化的现象。
上述的研究结果表明BER通路参与卵巢储备的维持并发挥重要作用。此外，我们发现年龄导致卵细胞Polβ基因表达量和活性下降，这与小鼠卵巢老化密切相关。Polβ在BER中发挥重要作用，Polβ缺陷会导致BER效率下降，使细胞无法及时修复DNA损伤，造成DNA损伤累积，最终导致细胞凋亡发生。我们通过对增龄卵细胞内过表达Polβ来抵御卵细胞应对外界不良环境刺激的能力，实现延缓卵巢老化的进程。
结论：Polβ介导的BER效率的下降是卵巢老化的原因之一。