研究背景及目的 在多器官功能衰竭(multiple organ failure, MOF)和全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)发生中,来自循环血液病原体和/或其毒素以及由此而刺激产生的细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)和炎症介质如脂多糖(LPS)等,均可导致血管内皮细胞(endothelial cells, ECs)通透性增高。近半个世纪的研究表明,可引起EC通透性升高的细胞因子和炎症介质种类繁多,其中虽然有一些因子可直接损伤EC,但绝大多数是通过使EC肌动蛋白细胞骨架(actin cytoskeleton)发生改变,EC发生收缩和/或回缩,进而EC之间的间隙(gap)增大,导致内皮通透性增高。近年人们对EC肌动蛋白骨架的内在调节机制,以及病理情况下骨架蛋白重新分布(reorganization)的信号转导机制及与细胞间隙变化的相关关系进行了一定的研究,认为Rho家族的GTP酶(Rho GTP ases)可能在细胞因子和炎症介质所致的内皮通透性增高中起着主要的信号转导作用。本文主要研究Rho家族中Rac1蛋白在血管EC形态和通透性变化中的作用,试图阐明Rac1是否为调节EC肌动蛋白细胞骨架改变的重要信号分子,及其在炎症介质介导的EC单层通透性增高中的信号转导作用。方法 (1) 根据Genebank hPBD mRNA序列,设计合成引物,从EC mRNA中克隆与Rac1和Cdc42相结合的人PAK1结合域(human <WP=5>p21 binding domain, hPBD),将其插入GST融合蛋白表达质粒,转化BL21宿主菌,表达与Rac1/Cdc42相结合的GST-hPBD融合蛋白,经亲和层析纯化后,用于pull down实验,测定EC中活化的Rac1蛋白含量。(2)应用pull down分析检测TNF-α和LPS刺激前后EC中Rac1蛋白的活化表达,应用Rhodamine-Phalloidin染色,荧光显微镜下观察EC骨架重排。以HRP为示踪剂测定刺激前后EC通透性的改变。通过上述工作探讨EC Rac1活性的变化与细胞肌动蛋白骨架、细胞间隙和内皮单层通透性改变的关系。结果 (1) DNA序列测定证实重组表达载体构建成功,经采用低温诱导表达相对分子量为36KD的可溶性GST-hPBD融合蛋白,亲和层析纯化得到纯度大于75%的GST-hPBD融合蛋白,并在pull-down实验中检测到活性Rac1蛋白的表达。(2) Western blot分析证实LPS作用1h,TNF-α作用2h,活化Rac1蛋白表达明显增加;LPS作用2h,TNF-α作用4h,Rac1蛋白表达达到峰值。(3) 在相应浓度剂量下,TNF-α和LPS可明显增加EC单层的通透性(p<0.05),并呈时间依赖性。(4) 荧光倒置显微镜下,正常血管EC形态呈规则圆形、多角形,排列紧密、整齐,细胞与细胞间和细胞基底膜之间的粘附连接紧凑,基膜完整,无明显的细胞间隙形成。TNF-α和LPS作用后细胞形态由圆形、多角形变成梭形,长宽比增大,细胞收缩,细胞间隙明显增大,排列紊乱。(5) 正常对照组EC F-actin主要分布于细胞膜侧,少量呈细丝状无序地分布于胞浆,核周偶有应力纤维形成。LPS、TNF-α刺激后EC内F-actin的构像和分布发生变化,边聚现象消失,胞浆内的F-actin明显增多,出现大量的应力纤维,并呈极性分布,呈典型竹排样结构。活化Rac1蛋白表达的增加与EC通透性增加、EC形态及细胞骨架变化在时相上具有相关性。结论 hPBD原核表达载体的成功构建及融合蛋白的表达纯化,为我们进一步探讨Rho GTPases的活性改变提供了一个良好的实验方法和实验基础。同时,细胞因子TNF-α和炎症介质LPS刺激引起的细胞内皮通透性改变和细胞内骨架重排,与细胞内活化Rac1蛋白的<WP=6>增加在时相上密切相关,提示Rac1蛋白可能在肌动蛋白骨架及细胞间隙改变和内皮单层通透性的增高中起着信号转导作用。