黄芩苷对胆管癌细胞的抑制作用及其机制研究

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目的:探究黄芩苷(Baicalin)对胆管癌细胞的抑制作用及其分子机制。方法:(1)Baicalin对胆管癌细胞活性的影响:体外培养胆管癌细胞QBC939和RBE,不同浓度的Baicalin处理后,通过CCK-8实验检测细胞活性。(2)Baicalin影响胆管癌细胞活性的机制:使用mTORC1信号通路抑制剂Rapa(雷帕霉素)或AZD(ATP竞争性mTOR激酶抑制剂)处理QBC939和RBE细胞后,通过CCK-8实验检测细胞活性。(3)Baicalin对胆管癌细胞增殖的影响:不同浓度的Baicalin处理QBC939和RBE细胞后,通过镜下观察细胞的生长速度,以及使用平板细胞克隆形成实验分析细胞增殖的情况。(4)Baicalin影响胆管癌细胞增殖的机制:不同浓度的Baicalin处理QBC939和RBE细胞后,通过Western blot检测细胞周期蛋白Cyclin D1和细胞周期蛋白抑制激酶p27的蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞周期。此外,Baicalin处理细胞后,使用siRNA干扰c-Myc,Western blot检测p27和Cyclin D1的蛋白水平。(5)Baicalin对胆管癌细胞凋亡的影响:不同浓度的Baicalin处理QBC939和RBE细胞后,通过Western blot检测凋亡标志物PARP和剪切的caspase3(c-caspase3)的表达水平。(6)Baicalin影响胆管癌细胞凋亡的机制:不同浓度的Baicalin处理QBC939和RBE细胞后,通过Western blot检测P70s6k,S6,raptor,AMPK及其磷酸化水平;此外,Rapa和AZD处理QBC939和RBE细胞后,通过Western blot检测PARP、剪切的caspase3(c-caspase3)的表达水平;随后,使用AICAR(AMPK激活剂)激活AMPK以及siRNA干扰AMPK的表达后,通过Western blot检测AMPK及其磷酸化的水平、raptor(Ser792和Ser863)及其磷酸化的水平、P70s6k、S6及其磷酸化的水平以及Rheb(mTORC1直接激活分子)、PARP和c-caspase3的蛋白表达水平。结果:(1)Baicalin抑制胆管癌细胞活性:不同浓度的Baicalin处理QBC939和RBE细胞后,CCK-8结果显示,细胞活性明显降低,且呈现出浓度和时间依赖性;(2)Baicalin通过mTORC1信号通路抑制胆管癌细胞活性:Rapa和AZD处理QBC939和RBE细胞后,CCK-8结果显示,细胞活性明显降低;(3)Baicalin抑制胆管癌细胞增殖:不同浓度的Baicalin处理QBC939和RBE细胞后,镜下观察到细胞生长速度明显减慢,同时平板细胞克隆形成实验也发现,细胞增殖能力明显降低;(4)Baicalin通过阻滞细胞周期抑制胆管癌细胞增殖:Baicalin处理QBC939和RBE细胞后,通过Western blot结果显示,与对照组相比,p27的蛋白水平明显增加,而Cyclin D1的蛋白水平明显降低,流式细胞术检测结果发现,QBC939细胞周期停滞在S期;进一步研究结果发现,不同浓度的Baicalin处理QBC939和RBE细胞后,Western blot结果显示,与对照组相比,c-Myc的蛋白水平明显降低,且呈现出浓度和时间依赖性;此外,使用siRNA干扰QBC939和RBE细胞中的c-Myc的表达后,Western blot结果显示,与对照组相比,p27蛋白的表达水平显著增加,而Cyclin D1的蛋白表达水平显著降低。(5)Baicalin诱导胆管癌细胞凋亡:不同浓度的Baicalin处理QBC939和RBE细胞后,Western blot结果显示,PARP和c-caspase3的表达水平明显升高,且呈现出浓度和时间依赖性;(6)Baicalin通过AMPK/raptor/mTORC1信号通路诱导细胞凋亡:不同浓度的Baicalin处理QBC939和RBE细胞后,Western Blot结果发现,与对照组相比,P70s6k、S6和raptor(ser792)的磷酸化水平明显降低,且呈现浓度依赖性;此外,Rapa和AZD处理QBC939和RBE细胞后,Western Blot结果显示,与对照组相比,PARP和c-caspase3的表达水平明显增加;另外,不同浓度的Baicalin处理QBC939和RBE细胞后,Western Blot结果显示,与对照组相比,AMPK的磷酸化水平明显上调,且呈现出浓度和时间依赖性;另一方面,AICAR处理QBC939和RBE细胞后,Western Blot结果显示,AICAR促进了AMPK和raptor在Ser792(直接磷酸化)处的磷酸化表达,但抑制了raptor在Ser863(间接磷酸化)处的磷酸化及Rheb的表达,反之亦然;进一步研究发现,AICAR处理QBC939和RBE细胞后,Western Blot结果显示,与对照组相比,P70s6k和S6的磷酸化水平明显降低,相反地,使用siRNA干扰AMPK的表达后,P70s6k和S6的磷酸化水平明显增加;此外,使用AICAR促进AMPK磷酸化与Baicalin联合处理细胞后,Western blot结果显示,PARP和c-Caspase3的蛋白表达水平明显增加,相反地,沉默QBC939和RBE细胞中AMPK的表达后,Baicalin诱导PARP和c-Caspase3的蛋白表达水平显著降低。结论:(1)Baicalin能抑制胆管癌细胞的活性、增殖并诱导细胞凋亡;(2)Baicalin通过抑制c-Myc抑制胆管癌细胞的增殖;(3)Baicalin通过AMPK/raptor/mTORC1信号通路抑制胆管癌细胞的活性并诱导胆管癌细胞凋亡。
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