辅助生殖技术(Assisted reproductive technology, ART)应用于临床30余年来,对不孕不育的治疗做出了巨大的贡献,然而多项ART技术尚未经长期、全面安全性评估而直接应用于临床,其安全性一直备受关注。近年来,大量流行病学研究不断发现,ART增加不良妊娠结局及子代近远期健康风险,如：流产、异位妊娠(Ectopic pregnancy, EP)、子痫前期、前置胎盘、早产、低出生体重儿、出生缺陷、表观遗传疾病、脑瘫及代谢性疾病等。研究ART后各种并发症和后代健康安全性,将有助于改进ART,成为当务之急。本研究从ART后EP风险和子代健康安全性两个方面,通过ART后多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome, PCOS)患者EP风险分析和子代脐带动脉血血清差异蛋白质组学研究,探讨ART的安全性。一、ART后PCOS患者EP风险分析EP是ART的并发症之一。据报道,ART后EP发生率高于自然妊娠EP发生率,其可能的原因包括接受ART治疗的女方不孕因素和ART控制性超促排卵治疗所导致的高雌、孕激素环境等。本中心前期初步筛选体外受精-胚胎移植(In vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET)周期中EP的危险因素,发现女方不孕因素PCOS是EP发生的高危因素。PCOS是育龄期妇女常见的内分泌及生殖功能紊乱性疾病,许多文献报道PCOS患者孕期并发症和胎儿围产期不良结局增高,包括流产、妊娠期糖尿病等。而关于EP,尽管一些研究报道了不同ART治疗后PCOS患者的EP发生率,但并未有研究关注PCOS和EP发生风险的关系。为了深入探讨IVF-ET治疗周期中女方不孕因素PCOS对EP发生风险的影响,我们对2007年1月至2011年12月在本中心获得临床妊娠的病例5339例进行了回顾性队列研究,其中PCOS患者为205例,非PCOS患者为5134例。本研究将新鲜胚胎移植周期与复苏胚胎移植周期分别分析,应用多因素logistic回归模型调整重要的混杂因素。结果显示在新鲜胚胎移植周期中控制性超促排卵治疗的刺激下(n=3303),对比非PCOS患者,PCOS患者发生EP的风险增高3.06倍[7.0% vs 2.4%,校正odds ratio(OR)=3.06,95％confidence interval(CI)1.34-6.96,P=0.008]；而在复苏胚胎移植周期无超促排治疗(n=2036),PCOS患者和非PCOS患者EP发生率相似(2.2% vs 2.0%,校正OR 0.94,95％CI0.22-4.07,P=0.941)。为了进一步研究这种现象发生的可能原因,我们用单因素分析筛选新鲜胚胎移植周期中,PCOS与非PCOS所有患者一般情况和周期治疗中的变量与EP的关系,结果发现hCG日的雌二醇水平为EP发生的危险因素,多因素logistic回归模型调整混杂因素后,高雌激素组患者(>4085pg/ml)对比低雌激素组患者(≤4085pg/ml)患EP的风险增高1.83倍[3.5%(29/825)vs 2.2%(54/2478),校正OR=1.83,95% CI 1.12-3.01,P=0.016].接着,在此多因素logistic回归模型中,我们对雌二醇和EP的关系根据有无PCOS进行分层分析,结果显示非PCOS组患者中,高雌激素组EP发生率显著高于低雌激素组患者[3.4%(27/789)vs 2.0% (48/2400),校正OR=1.99,95％CI 1.19-3.35,P=0.009]；而PCOS组患者中,高雌激素组和低雌激素组患者EP发生率均高,两者间无统计学差异[5.6%(2/36)vs 7.7%(6/78),校正OR=0.92,95% CI0.15-5.67,P=0.928]。此结果显示在新鲜胚胎移植周期超促排卵刺激后,PCOS患者在相对较低的雌激素水平下就会表现出高EP发生率,而非PCOS患者只有在高雌激素组才会有较高的EP发生率,提示PCOS患者在超促排卵刺激下激发EP发生的高雌激素阈值相比非PCOS患者降低,推测可能和PCOS患者对雌激素高敏感相关。此结果为新鲜胚胎移植周期中PCOS患者发生EP风险增高提供了一个可能的解释。本研究结果提示PCOS患者在超促排卵刺激后需要警惕EP的发生。复苏胚胎移植周期激素环境较接近生理情况,PCOS患者若选择复苏胚胎移植周期治疗可能会减少EP发生风险。而对于非PCOS患者,在超促排卵周期中控制超高雌激素的水平可能有助于减少EP的发生风险。二、ART子代脐带动脉血血清差异蛋白质组学研究在ART子代健康安全性方面,近年来很多研究证实ART技术的各环节包括超促排卵、胚胎体外培养、显微操作、胚胎冻融等步骤均有可能影响胚胎及胎儿的早期发育环境,引起胎儿在宫内发育程序性的变化,导致其妊娠并发症的发生或远期成年代谢性疾病的发病率增高(如心血管疾病等)。本课题组及一些研究报道了ART子代胎盘超微结构、基因表达谱及蛋白质组,以及ART子代脐血及胎盘甲基化水平,发现了一些可能由于ART技术所导致的异常改变,但对于ART出生子代脐带血血清蛋白质组的研究仍为空白。脐带血血清蛋白直接反映了胎儿的病理生理状况,对胎儿血清蛋白质组的研究可从分子角度更加敏感的反映胎儿健康状况及潜在近、远期健康风险,并可发现有意义的蛋白标志物。为了更好的评估ART后新生儿的健康状况,本研究采用未经胎盘交换的脐带动脉血血清作为研究对象。首先摸索出完善的脐带动脉血采血技术,收集江苏地区ART妊娠和自然妊娠出生的足月、单胎胎儿脐带动脉血,创建了胎儿脐带动脉血血清标本库。严格限制病例的入选标准,集中对ART操作本身的安全性进行研究。最终纳入新鲜胚胎IVF移植周期组、复苏胚胎IVF移植周期组和自然妊娠胎儿组脐带动脉血血清各13例进行研究。我们运用双向凝胶电泳结合质谱鉴定技术对脐带动脉血血清进行蛋白质组学分析,构建新鲜、复苏胚胎移植周期IVF来源胎儿的脐带动脉血血清差异蛋白表达谱。在去除血清14种高丰度蛋白质后,相比自然妊娠组,新鲜胚胎IVF移植周期组和复苏胚胎IVF移植周期组分别分离鉴定到19和16个差异蛋白点,对应15和12种差异蛋白质。我们随机选择了4种蛋白用Western blot的方法进行验证,表达趋势与蛋白质组学结果一致。对差异蛋白表达谱进行生物信息学分析显示差异表达蛋白共涉及7种生物学过程,包括代谢、先天免疫、炎症、血管功能障碍、氧化应激、大脑发育和性激素调节等,可能反映了ART所导致的胎儿适应性改变。通过对比新鲜胚胎IVF移植周期组和复苏胚胎IVF移植周期组差异蛋白谱的生物学功能,我们发现两组IVF子代脐血中均存在补体系统的受抑制现象；另外在新鲜胚胎IVF移植周期组脐带血血清差异蛋白中观察到近一半的差异蛋白为心血管代谢系统疾病的生物标志物,而在复苏胚胎IVF移植周期组未见此类差异蛋白,其他差异蛋白功能分类相似,提示复苏胚胎移植周期出生的子代可能有更好的结局。结论：(1)本研究通过ART后PCOS患者EP风险分析,发现新鲜胚胎移植周期中控制性超促排卵刺激后PCOS患者EP发生风险显著增高,而在复苏胚胎移植周期中未发现此关系。一个可能的解释是对比非PCOS患者,PCOS患者在超促排卵的刺激下激发EP发生的超生理雌激素的阈值降低。(2)本研究通过对ART子代脐带动脉血血清差异蛋白质表达谱的研究,发现对比自然妊娠出生子代,新鲜和复苏胚胎移植周期IVF子代脐带血血清中均存在显著差异表达蛋白,提示两组IVF子代均可能存在健康风险。其中,两组子代脐血中均存在补体系统受抑制状态；仅在新鲜胚胎IVF移植周期组差异蛋白表达谱中观察到近一半的差异蛋白为心血管代谢系统疾病的生物标志物,而在复苏胚胎IVF移植周期组未见此类差异蛋白,提示复苏胚胎移植周期出生的子代可能有更好的结局。(3)从以上两方面考虑,选择复苏胚胎移植周期治疗可能降低PCOS患者ART后EP发生风险及ART子代可能存在的部分健康风险。(4)本研究为改进ART临床治疗和操作提供一定的理论依据,从新的角度丰富了ART安全性资料,对完善临床工作具有指导意义。