选题依据:癌症是严重威胁人类健康的重大疾病之一,已成为我国最为严重的公共卫生问题。2019年统计数据显示,我国肿瘤发病人数为392.9万余人,癌症增长率为3.2%,意味着我国每天癌症确诊人数超过1万,每分钟就有7.5人被确诊为癌症患者。近年来,化学疗法的进步极大地改善了癌症治疗效果,但是由于化疗药物的细胞毒性常常会使患者出现白细胞减少症,严重影响患者的耐受性,导致化疗终止,增加癌症死亡率。因此,如何有效的改善白细胞减少症、使癌症化疗得以顺利进行成为急需解决的重大问题之一。现有治疗白细胞减少症的化学药物如维生素B4、鲨肝醇、利血生等,多数患者存在停药后白细胞减少症再次复发的现象;而新型药物如重组人粒细胞集落刺激因子会对肌肉骨骼和消化系统产生副作用,严重影响到化疗的连续性。此外,这些药物在治疗化疗引起的白细胞减少症的同时,是否对肿瘤发展变化产生影响尚不清楚。因此研究和开发药效明确、毒副作用小、价格低廉的治疗肿瘤化疗后白细胞减少症的药物具有重要临床意义和价值。驴胶补血颗粒作为治疗气血亏虚、疲乏无力的良药,具有滋阴补血、健脾益气、调经活血等特点,常用于治疗久病体虚、气虚血亏等疾病。中医学常将白细胞减少症归为“血虚”、“虚劳”等范畴,这些症状恰好与驴胶补血颗粒的功效不谋而合。已有临床证据表明,驴胶补血颗粒可升高癌症化疗患者的白细胞(WBC)水平,提高了化疗的顺应性,改善了患者的生存质量。但是对于驴胶补血颗粒升高白细胞的药理作用机制尚不清楚,限制了临床医生对于该药物在治疗白细胞减少症方面的合理应用。因此,本研究通过建立环磷酰胺(CTX)诱导的4T1荷瘤小鼠白细胞减少症实验动物模型,并给予驴胶补血颗粒观察其对小鼠白细胞减少症的改善作用,同时结合代谢组学、生物网络分析、分子生物学等技术全面阐明其作用机理,为该药物在辅助癌症化疗方面的临床合理应用提供科学依据。目的:研究驴胶补血颗粒改善CTX诱导的4T1荷瘤小鼠白细胞减少症的药理作用,并采用代谢组学、生物网络分析、分子生物学等手段对其作用机制进行研究。方法:(1)驴胶补血颗粒药效学研究:采用CTX诱导4T1荷瘤小鼠白细胞减少症模型,以血常规、脏器指数、抑瘤率和脾脏淋巴细胞亚群数量为药效指标,考察驴胶补血颗粒对白细胞减少症的改善作用。(2)代谢组学研究:使用~1H-NMR代谢组学的方法对收集小鼠血液和脾脏的代谢物进行分析。首先对标准化数据执行主成分分析(PCA)以识别对照组、模型组和给药组之间的分散程度,并消除异常值。接下来使用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)来可视化区分对照组、模型组和药物组之间的代谢谱差异。正交偏最小二乘法判别(OPLS-DA)用于寻找对照组和模型组之间的代谢物的VIP值。最后,在SPSS 21.0软件中对代谢物进行ANOVA分析,VIP>1和P<0.05的代谢物被确认为差异代谢物。(3)生物靶标网络分析:采用UHPLC-Q Exactive轨道肼高分辨质谱分析了驴胶补血颗粒化学成分,并结合TCMSP和TCMID对找出的化学成分进行补充和筛选,建立驴胶补血颗粒化学成分数据库。将筛选出的化学成分导入PharmMapper服务器进一步找出活性成分的作用靶点,将所得到的靶点与差异代谢物的靶点相关联取交集,从而建立“活性成分-靶点网络”。将所找出的靶点导入String数据库,构建蛋白相互作用网络,阐明代谢酶之间的关系。采用ClueGO插件对所找出的靶点进行KEGG和GO分析,找出关键代谢通路。最后,采用Systems Dock软件将关键代谢通路中的靶点与驴胶补血颗粒活性成分进行分子对接研究,以验证结果的准确性。(4)实验验证:代谢组学及生物靶标网络分析中KEGG通路分析结果显示BCAAs分解代谢可能是驴胶补血颗粒改善CTX诱导的4T1荷瘤小鼠白细胞减少症最为重要的作用途径。首先分别给予人外周血单核细胞(PBMC)和小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)两种细胞BCKDK激酶(可抑制支链α-酮酸脱氢酶复合物的表达)的抑制剂苯丁酸,观察细胞的增殖活性,以验证BCAAs分解代谢途径中的关键酶对体外细胞的影响。其次给PBMC和RAW264.7两种细胞外源性补充一定浓度的BCAAs,观察其是否具有增值细胞活性的作用。最后,采用ELISA试剂盒对BCAAs分解途径中的关键限速酶酰基辅酶A脱氢酶(ACADS)和支链酮酸脱氢酶(BCKDHA)的含量进行测定,从而从分子水平对代谢组学和生物靶标网络分析结果进行实验验证。结果:(1)药效作用结果:驴胶补血颗粒可改善CTX造成的体重减轻和一般状态,加速WBC,中性粒细胞(NE),淋巴细胞(LY),单核细胞(MO)和红细胞(RBC)含量的恢复,回调CTX所造成的脏器指数的改变;可通过改善脾脏淋巴细胞亚群的比例来提高小鼠免疫,从而改善白细胞减少症;在改善白细胞减少症的同时,一定程度上增加了CTX抗肿瘤的作用,具有“减毒增效”的药效特点。(2)代谢组学研究结果:血清代谢组学分析共指认出包括氨基酸、糖类以及有机酸在内的31种内源性代谢产物。与空白对照组相比,模型组小鼠血清中乳酸、脂质和谷氨酸的含量显著升高,而β-葡萄糖、甜菜碱、丙酮酸、谷氨酰胺、O-乙酰糖蛋白和肌酐的含量显著降低,驴胶补血颗粒能显著逆转血清代谢异常。WBC的含量变化与谷氨酰胺、O-乙酰糖蛋白、丙酮酸、肌酐、β-葡萄糖和甜菜碱的水平变化呈正相关,与乳酸和谷氨酸的水平变化呈负相关,说明这些差异代谢物的改变可能与驴胶补血颗粒治疗作用有关。脾脏代谢组学分析共指认出脾脏中32种内源性代谢产物。与空白对照组相比,模型组小鼠脾脏中TMAO、丙酮酸、GPC、牛磺酸和谷氨酸水平明显升高,胆碱、肌醇、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、PC、α-葡萄糖和苯丙氨酸的含量较低,这些内源性代谢物的变化可能是CTX引起的白细胞减少症的直接结果,通过给予驴胶补血颗粒可显著回调代谢物的水平。血常规指标WBC、RBC、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、NE、LY、MO、MCH与差异代谢物谷氨酸、丙酮酸、天冬氨酸、GPC、牛磺酸、谷氨酸和TMAO呈负相关,与缬氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,胆碱,PC,肌醇,α-葡萄糖,酪氨酸和苯丙氨酸呈正相关。此外,脾脏指数与差异代谢物之间也存在明显的相关性,这表明驴胶补血颗粒可能通过平衡脾脏代谢物的紊乱来发挥升高白细胞的作用。代谢组学研究结果表明,驴胶补血颗粒能够调节的差异代谢物主要与氨基酸代谢有关,包括谷氨酸和谷氨酰胺的转化、苯丙氨酸代谢、支链氨基酸代谢等,此外还涉及能量代谢和胆碱代谢等多个生物途径,体现了驴胶补血颗粒多成分、多靶点的整体调节作用机制。(3)生物靶标网络分析结果:将驴胶补血颗粒LC-MS化学成分分析结果与TCMSP和TCMID对找出的化学成分进行整理后,结合文献报道共筛选出35个活性成分。将驴胶补血颗粒化学成分导入PharmMapper服务器数据库获取靶点,去重复后获得872个靶点。将代谢物的靶点和活性成分的靶点两者取交集,共得到驴胶补血颗粒活性成分调控代谢物的32个作用靶点。将驴胶补血颗粒活性成分、作用靶点、差异代谢物导入Cytoscape软件绘制“活性成分-靶点-代谢物”网络,共涉及35个驴胶补血颗粒的活性成分、32个靶点和14个差异代谢物。通过拓扑分析发现,Rehmannioside A、Catalpol、AstragalosideⅡ和AstragalosideⅠ等成分在靶标网络中发挥重要作用而IL4I1、BCAT2、BCAT1、PLA2G4A、LYPLA3等可能是驴胶补血颗粒发挥升白作用的关键靶点。驴胶补血颗粒改善CTX诱导的4T1荷瘤小鼠白细胞减少的作用靶点主要以酶为主,主要包括核氧化还原酶、转移酶、水解酶、异构酶和裂解酶等,此外还包含钙结合蛋白、酶调节剂、受体和信号分子等,其中氧化还原酶、转移酶、水解酶出现的频率较高,而这些酶与氨基酸分解代谢密切相关,提示驴胶补血颗粒可能通过干预氨基酸分解代谢发挥改善CTX诱导的4T1荷瘤小鼠白细胞减少症的作用。KEGG通路分析结果表明,驴胶补血颗粒32个作用靶点主要参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的分解途径(BCAAs分解途径),此外还参与了半胱氨酸和蛋氨酸代谢、糖酵解/糖异生途径和丙酮酸代谢等代谢途径,充分体现了驴胶补血颗粒多成分、多靶点、整体调节的作用特点。GO富集分析结果表明,小分子分解代谢过程是这些作用靶点最为重要的生物功能,共涉及19个作用靶点。此外,羧酸分解过程、有机酸分解过程和细胞氨基酸分解代谢过程等生物途径也受到驴胶补血颗粒的调节。综合KEGG与GO分析结果得知,支链氨基酸(BCAAs)分解途径可能为驴胶补血颗粒发挥升高白细胞作用的主要途径。为了进一步证实驴胶补血颗粒调控BCAAs分解代谢的途径,进行了分子对接验证实验,结果表明驴胶补血颗粒的主要活性成分与BCAAs分解途径作用靶点的对接得分均显著高于天然配体,表明上述活性成分与关键作用靶点具有很好的结合活性,证明了驴胶补血颗粒可通过调节BCAAs分解代谢来改善CTX诱导的4T1荷瘤小鼠白细胞减少症。本部分通过将驴胶补血颗粒的活性成分与差异代谢物的靶点进行整合分析,发现驴胶补血颗粒可能主要通过调控部分氨基酸分解代谢来发挥升白作用其中的BCAAs分解代谢途径可能为其发挥药效的主要途径。为了进一步揭示驴胶补血颗粒如何调控BCAAs分解途径改善CTX诱导的4T1荷瘤小鼠白细胞减少症的作用机制,采用分子生物手段进一步进行了相关的实验验证。(4)实验验证结果:给予BCAAs分解代谢中负调控酶BCKDK的抑制剂苯丁酸实验结果表明,当苯丁酸浓度在180~2880μm/L时,RAW264.7的细胞活力被显著抑制,当苯丁酸浓度在720~2880μm/L时,PBMC细胞被显著抑制。出现以上结果的原因是由于BCKDK激酶被苯丁酸所抑制,导致BCKDH被激活,整个BCAAs分解代谢通路所消耗的支链氨基酸增多,从而使细胞活力减弱,这与代谢组学的结果是一致的。外源性补充BCAAs实验结果表明,当BCAAs浓度在180~2880μm/L时,可显著促进RAW 264.7细胞的增殖,而浓度在1440μm/L和2880μm/L时可显著促进外周血细胞PBMC的增殖。该结果表明,BCAAs和驴胶补血颗粒对外周血细胞和免疫细胞的增殖起到促进作用,证明了驴胶补血颗粒可通过回调BCAAs的含量来改善CTX诱导的4T1荷瘤小鼠白细胞减少。对BCAAs分解代谢途径的关键限速酶的含量进行测定,与空白对照组相比,模型组小鼠ACADS和BCKDHA酶含量显著升高,说明BCAAs代谢通路被激活,使得BCAAs过度被消耗,证实了生物靶标网络分析和代谢组学分析的结果。给予驴胶补血颗粒后,小鼠ACADS和BCKDHA酶含量显著回调,说明驴胶补血颗粒可通过干预BCAAs代谢通路来发挥改善作用。结论:驴胶补血颗粒能够显著改善CTX诱导的4T1荷瘤小鼠WBC减少、脏器损伤和免疫功能下降等症状,并且对肿瘤发展有一定的抑制作用。其作用机制可能是通过干预ACADS和BCKDHA酶的表达,调控BCAAs分解代谢途径,回调BCAAs的水平来发挥作用。