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喉癌是耳鼻喉科最常见的恶性肿瘤,由于喉癌生长部位的特殊性,且手术、放射和化学治疗仍然存在并发症多、毒副作用大的问题,给患者带来较大的痛苦。因此,急需要在分子生物学的基础上提出新的诊断方法和简便、有效的治‘疗手段,这已成为当前研究的热点课题。虽然肿瘤发病机制迄今尚不明了,但可以肯定的是肿瘤的发生发展是多步骤、多阶段和多基因参与并异常表达的过程。很多科研机构研究结果发现肿瘤中存在很小比例的具有干细胞特性的肿瘤细胞,称其为瘤干细胞样细胞(Cancer stem cell-like cells, CSCLC),研究者认为这些CSCLC在肿瘤的起源和发展过程中起着关键的作用。虽然该学说目前的争议较大,但是有一点可以明确的是,肿瘤细胞中应该存在某些调控自我更新的关键基因的异常表达,这是保证肿瘤细胞失控的、异常的、单克隆无限制增殖的基础。生物体内有一系列信号分子维持着干细胞多能性,目前研究的最为广泛是OCT-4。OCT-4基因是POU转录因子家族的一个成员,在胚胎干细胞和成人干细胞上均有表达,参与胚胎发育过程中多向性分化的调节,而且可以控制其无限增殖的特性。目前研究发现OCT-4不仅在多能性胚胎干细胞和原始生殖细胞中表达,在某些恶性生殖细胞肿瘤如精原细胞瘤、胚胎性癌及实体瘤内也检测到了OCT-4的异常表达。有关在喉鳞状细胞癌中OCT-4的表达及其意义的研究,迄今国内外鲜有报道。为深入探讨OCT-4基因与喉癌恶性生物学行为的关系,明确OCT-4在喉癌发生、发展中的作用,寻求喉癌诊断、治疗和预后指标及寻找抑制喉癌发生、发展的有效方法,本研究检测了喉癌组织、癌旁正常组织及声带息肉组织中OCT-4的表达情况,探讨了OCT-4与喉癌恶性生物学行为的关系。并构建了携带OCT-4mRNA编码区cDNA序列和siRNA序列的真核表达载体来研究OCT-4对喉癌Hep-2细胞增殖及p-STAT3/STAT3和Survivin表达水平的影响；检测了丙戊酸钠(VPA)对喉癌Hep-2细胞OCT-4、p-STAT3/STAT3和Survivin表达水平的影响；通过裸鼠移植瘤实验进行体内试验,从多个方面深入探讨OCT-4和VPA对喉癌Hep-2细胞的影响,试图阐明OCT-4的表达在喉癌发生、发展中的意义；并进一步阐明OCT-4基因的抑制和VPA处理对喉癌Hep-2细胞增殖的抑制是否与下调STAT3蛋白磷酸化水平及Survivin的表达有关。为进一步探讨喉癌发生、发展的机制及寻找抑制喉癌发生、发展的治疗途径提供理论基础。本研究共分以下4章。第一章：OCT-4和Survivin在喉鳞状细胞癌组织中的表达及意义方法采用免疫组织化学、Real-time PCR和western的方法检测77例喉癌组织、18例癌旁正常组织及15例声带息肉组织之中OCT-4和Survivin的表达情况。结果喉癌组织OCT-4和Survivin阳性表达高于癌旁正常组织和声带息肉组织,三种喉组织表达差异有统计学意义(P<0.01);OCT-4阳性表达率与喉癌患者病理分级和淋巴结转移有关(P<0.01);Survivin阳性表达率与喉癌患者病理分级、淋巴结转移和T分期有关(P<0.01)。且喉癌组织中OCT-4和Survivin的表达相互之间呈明显的正相关(P<0.05)。第二章：OCT-4对喉癌Hep-2细胞影响的体外研究方法1.构建携带人OCT-4基因mRNA编码区全长cDNA序列和特异性siRNA序列的真核表达质粒载体,转染并筛选出阳性稳定转染细胞克隆。2.采用MTT和平板克隆法测定对照组和各转染组Hep-2细胞增殖和克隆能力。3.采用流式细胞术(FCM)测定对照组和各转染组Hep-2细胞周期和凋亡的情况。4.采用Real-time PCR和Western blot的方法检测对照组和各转染组Hep-2细胞p-STAT3/STAT3和Survivin表达的情况。结果1. pcDNA3.1-OCT-4和pSUPER-EGFP-OCT-4真核表达载体构建及转染Hep-2细胞成功。2.MTT实验结果显示：与对照组相比,pcDNA3.1-OCT-4-2组细胞增殖和克隆能力明显增强(P<0.01),而pSUPER-EGFP-OCT-4-c组细胞增殖和克隆能力明显减弱(P<0.01),pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空质粒组则无明显差异(P>0.05)。3.FCM结果显示：与对照组相比,pcDNA3.1-OCT-4-2组G0/G1期细胞比例明显减少(P<0.01),S和G2/M期细胞比例升高(P<0.05); pSUPER-EGFP-OCT-4-c组G0/G1期细胞比例明显升高(P<0.01),S和G2/M期细胞比例减少(P<0.05),同时与各组相比其凋亡率增加；pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空质粒组则无明显差异(P>0.05)。4. Real-time PCR和western结果显示：与对照组相比,pcDNA3.1-OCT-4-2组细胞p-STAT3蛋白、Survivin mRNA和蛋白表达升高,而在pSUPER-EGFP-OCT-4-c组表达降低(P<0.01), pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空质粒组表达则无明显差异(P>0.05)。第三章：VPA对喉癌Hep-2细胞增殖作用的影响及机制研究方法1.采用MTT方法检VPA作用后Hep-2细胞增殖活性的改变,计算其抑制率。2.采用FCM检测经3mmol/L VPA作用0(对照组)、24、48、72h后Hep-2细胞细胞周期和凋亡情况。3.采用Real-time PCR和western方法检测经3mmol/L VPA作用0(对照组)、24、48、72h后Hep-2细胞OCT-4、p-STAT3/STAT3和Survivin表达的情况。结果：1.MTT结果显示：VPA对Hep-2细胞的生长抑制作用具有剂量和时间依赖性。2.FCM结果显示：经3mmol/L VPA作用后,随着时间的增加,G0/Gl期细胞比例逐渐升高(P<0.01),S期细胞比例逐渐降低(P<0.01),而G2/M期细胞比例无明显变化(P>0.05),细胞凋亡率呈时间依赖性逐渐增加。3. Real-time PCR和Western blot结果显示：经3mmol/L VPA作用后,随着时间的增加,OCT-4 mRNA和蛋白表达逐渐升高(P<0.01), p-STAT3蛋白及Survivin mRNA和蛋白的表达逐渐降低(P<0.01)。第四章：OCT-4和VPA对喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤的影响及机制研究方法1.建立人喉癌裸鼠移植瘤模型。分为对照组、pcDNA3.1-OCT-4-2组、pSUPER-EGFP-OCT-4-c组和VPA实验组。每周测量瘤体大小,绘制肿瘤体积生长曲线。治疗终止时处死小鼠,剥除肿瘤称重,计算抑瘤率。2.采用TUNEL法检测各组裸鼠移植瘤组织中肿瘤细胞凋亡情况,统计细胞凋亡指数。3.采用Real-time PCR和western检测各组裸鼠移植瘤组织中OCT-4、p-STAT3/STAT3和Survivin表达情况。Results1. pcDNA3.1-OCT-4-2组裸鼠移植瘤体积显著大于对照组裸鼠移植瘤体积,组间比较差异具有统计学意义(P< 0.05); pSUPER-EGFP-OCT-4-c组和VPA组裸鼠移植瘤体积显著小于对照组裸鼠移植瘤体积,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。2. TUNEL结果显示pSUPER-EGFP-OCT-4-c组和VPA组裸鼠移植瘤组织中凋亡细胞与对照组相比明显增多,组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)。3. pcDNA3.1-OCT-4-2组和VPA组裸鼠移植瘤OCT-4 mRNA和蛋白表达显著高于对照组,组间比较差异具有统计学意义(P<0.01); pSUPER-EGFP-OCT-4-c组显著低于对照组,组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)。pcDNA3.1-OCT-4-2组裸鼠移植瘤p-STAT3蛋白及Survivin mRNA和蛋白表达显著高于对照组,组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)；pSUPER-EGFP-OCT-4-c和VPA组显著低于对照组,组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)。STAT3蛋白在每一组都没有明显变化。结论1.OCT-4在喉癌组织中高表达,与喉癌的病理分级和淋巴结转移密切相关,与Survivin的表达相互之间呈明显的正相关；OCT-4促进喉癌Hep-2细胞的增殖和克隆,当抑制其表达时会导致细胞增殖和克隆能力的减弱,阻滞细胞于G0/G1期,诱导凋亡；其机制与抑制p-STAT3和Survivin表达密切相关。2.VPA可以抑制Hep-2细胞的增殖,阻滞细胞于G0/G1期,诱导凋亡。VPA可以下调p-STAT3和Survivin表达来抑制肿瘤的发生、发展。3.体内试验与体外实验结果相似,抑制OCT-4的表达或给与VPA处理均可通过下调p-STAT3和Survivin表达来抑制肿瘤的发生、发展。