研究背景：随着医学水平的不断发展,心脏移植成为目前越来越多的终末期心脏疾病如扩张型心肌病、缺血性心肌病、心力衰竭等的最主要的治疗手段。但是,心脏移植技术仍然面临许多的难题需要克服。因此,心脏移植供体来源紧缺,供体保存时间受限,心脏移植术后并发症如排斥反应、感染、同种异体移植物血管病及大量免疫抑制剂应用的副作用等成为了近年来心脏移植领域的热点问题。目前,离体心脏的低温缺血保存时间被限制在4-6小时,而且保存效果还很大程度上受到保存技术及各种保存策略的影响。近年来,随着分子生物学的研究发展,特别是转基因技术的飞速进步,人们开始不断尝试将转基因技术应用于疾病治疗领域。在心脏移植供体心脏离体保存状态下,心脏心肌细胞的所处的物理及生化条件,必然影响到心脏保存时间以及移植术后状态。因此,在心脏离体保存期间,物理性的保护措施以及转入外源基因使之表达特定转基因产物均有可能会影响到心脏保存过程中缺血再灌注损伤的产生以及移植术后的排斥反应。基因治疗方式通过向生物体内导入特定的目的基因,使其表达相应的转基因产物达到影响生物体的生理功能。为了适应不同基因导入需求,各种基因载体被相继构建并应用。腺病毒载体也因其应用细胞广泛,获取方式简单可行,转染效率高获得了较多的关注。本实验的研究目的为在供体心脏离体保存于HTK心脏保存液状态下,使用升主动脉灌注配合低温浸泡方法转染外源性绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的空载重组腺病毒(Ad-GFP),探讨该方法用于心脏移植过程中的供心保护与基因导入策略的可行性。经过离体保存及腺病毒转染处理后的供体心脏异位移植于小鼠腹部,通过观察心脏跳动存活时间及使用不同方式检测重组腺病毒所携带的绿色荧光蛋白的表达情况,摸索通过体外转染腺病毒介导外源基因应用于心脏移植的模型的建立,为将外源目的基因导入并应用于心脏保护及减轻移植术后免疫排斥反应等研究创造条件。第一部分通过HEK293T细胞扩增腺病毒目的：探讨通过腺病毒感染人胚胎肾细胞(HEK)293T细胞进行生产制备的方法及其可行性。方法：利用一定感染复数(MOI)稀释的腺病毒保存液感染处于指数扩增期的HEK293T细胞,使其大量复制扩增。随着HEK293T细胞的细胞周期成长变化,生产制备出大量腺病毒。利用不连续密度氯化铯梯度离心及蔗糖透析去除氯化铯盐成分等方法进行腺病毒保存液的纯化,病毒纯化完成后通过50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定所扩增腺病毒的病毒滴度。结果：HEK293T细胞可用于生产制备带有绿色荧光蛋白GFP标记的腺病毒(Ad-GFP),转染后本身可在荧光显微镜下观察到绿色荧光的表达。所扩增的腺病毒经过TCID50方法测定,滴度达到9.52×1010PFU/ml。结论：通过不断感染HEK293T细胞并扩增增长的方式,可以大量生产制备腺病毒,获得较高滴度的腺病毒以用于后续实验。第二部分体外灌注腺病毒转染供体心脏目的：利用体外灌注腺病毒并保存离体小鼠心脏,探讨外源基因转染供体心脏组织的方法。方法：小鼠心脏离体处理后,浸泡于冰的HTK心脏保存液中,实验组(腺病毒灌注组)使用微量灌注泵经升主动脉位置缓慢泵入腺病毒保存液,对照组(HTK液灌注对照组)以同样方法灌注等量HTK保存液。缓慢均匀的灌注两小时后异位移植心脏至小鼠腹部。结果：经过两小时离体保存及灌注处理后,小鼠心脏外观形态质感均未发生明显改变,均适宜完成小鼠腹部异位心脏移植。结论：经过升主动脉位置灌注离体心脏的方法相当于沿冠状动脉的血流方向灌注,使心肌周围更为均匀的分布腺病毒,转染效率更高,方法有效可行。第三部分小鼠腹部心脏移植及术后检测目的：建立小鼠腹腔异位心脏移植模型,用于观察移植术后供体心脏存活情况及腺病毒标记基因GFP的表达情况。方法：建立小鼠腹部异位心脏移植模型,将供体主动脉端侧吻合于受体腹主动脉,供体肺动脉端侧吻合于受体下腔静脉。异系移植使用Balb/c小鼠供心移植于C57BL/6J小鼠腹部,主要用于观察实验组(腺病毒灌注组)与对照组(HTK液灌注对照组)供心生存曲线差别,主要比较两组小鼠移植术后供体心脏的存活时间；同系移植组使用Balb/c小鼠供心移植于Balb/c小鼠腹部,主要用于比较实验组与对照组之间炎症浸润情况以及标记物表达情况,检测方法包括移植后供体心脏组织冰冻切片后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白宏观表达情况；移植2,3,4,5,7天后的供体心脏冰冻切片进行HE染色,比较腺病毒灌注处理后心肌结构变化情况；提取移植2,3,4,5,7天后的供体心脏总RNA,使用Real-Time PCR方法检测绿色荧光蛋白GFP基因表达情况；提取移植2,3,4,5,7天后的供体心脏蛋白质,使用Western-Blot方法检测绿色荧光蛋白的表达情况。结果：异系移植组中使用体外灌注转染腺病毒的方法对于两组小鼠心脏生存时间无明显差别(P>0.05),其中实验组(9.40±±1.02)d,对照组(9.80±1.33)d。同系移植组中,经过移植后供心冰冻切片荧光显微镜下观察,可以发现腺病毒(Ad-GFP)灌注组中绿色荧光蛋白的表达；供体心脏冰冻切片HE染色,结果发现腺病毒灌注处理未引起明显心肌结构变化及炎性反应；Real-Time PCR检测发现,供体心脏组织中存在绿色荧光蛋白GFP基因的复制,随着移植时间增加而逐渐增多,第四天表达最多(P<0.01),之后出现减少趋势。Western-Blot检测结果出现类似趋势,第五天检测到绿色荧光蛋白出现高峰(P<0.01)。结论：通过体外灌注方法进行腺病毒转染用于小鼠腹部异位心脏移植,本模型能够使腺病毒所携带基因稳定转染并在一定时间内规律表达,且对小鼠供体心脏状态无明显影响。