叶酸（Folate）是一种水溶性B族维生素（维生素B9）,在动植物机体新陈代谢和生长发育过程中发挥着十分重要的作用,而人类和其他动物普遍存在叶酸摄入不足的问题。通过生物强化手段提高作物中的叶酸含量,是解决食物中叶酸普遍缺乏问题的有效策略。大量研究表明,GTP环化水解酶I（GCHI）与氨基脱氧分支酸合酶（ADCS）是植物叶酸合成过程中最主要的两种限速酶,二者编码基因GCHI和ADCS的共表达能够显著提高诸多转基因作物的叶酸含量。然而迄今为止,有关牧草叶酸生物强化的研究尚无相关报道。实验室前期从叶酸含量较为丰富的紫花苜蓿（Medicago sativa）中克隆得到其叶酸生物合成关键酶GCHI和ADCS的编码基因MsGCHI和MsADCS。在此基础上,本研究构建了MsGCHI和MsADCS基因的双价植物表达载体,并将其导入优良豆科牧草百脉根（Lotus corniculatus）中,通过分子鉴定筛选出目的基因表达量相对一致、且表达水平较高的转基因百脉根株系;在温室和大田条件下,对上述株系中的叶酸及其组分含量进行分析,并系统评价其生长性状,取得以下主要结果:1.成功获得携带除草剂抗性选择标记基因Bar的MsGCHI和MsADCS基因的双价植物表达载体,采用农杆菌介导法将其转化到百脉根中,通过PCR鉴定,获得13株阳性植株,随后对这些阳性植株进行RT-PCR和RT-qPCR分析,筛选出5株MsGCHI和MsADCS基因表达水平均相对较高的转基因株系。2.MsGCHI和MsADCS基因的共表达上调了转基因百脉根中若干叶酸生物合成及调控相关酶编码基因的转录水平。与野生型相比,转基因百脉根株系中氨基脱氧分支酸裂解酶（ADCL）、双功能羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶/二氢蝶呤合成酶（HPPK/DHPS）、二氢叶酸还原酶（DHFR）和二氢新喋呤醛缩酶（DHNA）编码基因的表达量均显著增加。3.MsGCHI和MsADCS基因的共表达显著增加了转基因百脉根中叶酸及其前体（蝶呤和p-ABA）的含量。采用HPLC-MS/MS法分析发现,无论在温室还是大田条件下,转基因株系中的叶酸、蝶呤和p-ABA含量均显著高于野生型,最高分别提高了3.3倍、6.1倍和3.7倍;转基因株系叶中叶酸含量显著高于茎,而除GA-5株系外,各株系的茎中蝶呤和p-ABA含量显著高于叶。4.转基因百脉根中叶酸衍生物含量相比野生型显著提升。温室条件下,转基因株系叶中5-甲基四氢叶酸（5-M-THF）和5-甲酰基四氢叶酸（5-F-THF）含量提高幅度最大,分别是野生型的1.9倍和2.1倍;大田条件下,转基因株系叶中5-F-THF提高最多（1.1倍）,茎中5-M-THF和5-F-THF含量分别比野生型提高了0.5倍和0.8倍。此外,各株系叶中5-M-THF、5,10-亚甲酰基四氢叶酸（5,10-CH=THF）和四氢叶酸（THF）含量显著高于茎中,除GA-11株系外,各株系茎中5-F-THF含量显著高于叶。5.MsGCHI和MsADCS基因的共表达促进了转基因百脉根的生长。温室条件下,转基因株系GA-3的生长速度和生物量、转基因株系GA-11的分枝数和根长均明显优于野生型。与野生型植株相比,大田移栽42天后,转基因株系叶片变大,叶面积显著增加了61.2%;移栽68天后,转基因百脉根株系的分枝数显著增加了18.0%,而其株高则在移栽82天后显著提高了6.8%。有趣的是,转基因株系的营养生长期延长、花期晚于野生型,且其初花期叶茎比较野生型显著提高了18.9%。此外,转基因百脉根株系还具有除草剂（草铵膦）抗性。以上结果表明,MsGCHI和MsADCS的共表达能够促进转基因百脉根的生长,并显著提高其叶酸和其前体、以及各衍生物的含量,研究结果为培育高叶酸含量百脉根新品种以及通过生物反应器生产叶酸奠定了坚实的理论与实践基础。