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背景阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease,AD）,又称作老年痴呆症,是最常见的神经系统退行性疾病,伴有认知和记忆功能障碍,起病隐匿并进行性进展,主要发生在老年人,同时其发病率随着年龄的增加而增加。AD约占痴呆类型的60%～80%,是最常见的痴呆原因。AD临床上主要表现为渐进性记忆障碍、语言学习障碍以及认知功能障碍等。主要病理特征包括在神经元外β-淀粉样蛋白（Amyloid beta,Aβ）的异常沉积形成的老年斑（senile plaques,SP）,以及神经元内Tau蛋白异常磷酸化形成的神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFTs）。虽然对AD的致病机制和临床治疗研究发展迅速,但AD的发病机制还未阐明,目前也没有有效的药物来预防或治疗AD。因此,亟待进一步解释AD的关键发病机制和开发有效的治疗手段。表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR）家族是为单次跨膜受体,包括HER1（ErbB1,EGFR）、HER2（ErbB2,NEU）、HER3（ErbB3）及HER4（ErbB4）。该受体家族成员在结构上相似,在中枢神经系统发育过程中起着重要的生理生化作用,广泛参与包括神经元迁移、突触形成,髓鞘化等神经生物学过程,其中ErbB4最具代表性。然而,ErbB4在神经退行性疾病尤其是在AD中的生物学功能和作用机制尚不十分清楚。目的本文旨在利用生物信息学分析技术,基于分析AD发生发展过程中关键的核心驱动基因和信号通路,寻找新的AD生物标志物和潜在的AD治疗靶点,分析AD潜在的致病机制。同时,基于分子对接法靶向人类ErbB4（human ErbB4,h ErbB4）蛋白虚拟筛选小分子化合物,探讨虚拟筛选小分子药物对ErbB受体的激活作用,并初步探究其对AD潜在的治疗作用。方法本文分为生物信息学分析鉴定AD核心驱动基因部分和基于分子对接法靶向h ErbB4受体虚拟筛选小分子化合物对AD潜在的治疗的体外实验研究。1)生物信息学分析鉴定AD核心驱动基因:从GEO数据库（Gene Expression Omnibus database）和阿尔兹海默病数据库（Alz Data）下载了12套AD相关数据集,并利用R软件对12套数据集进行了数据质量控制处理,同时去除不同数据集之间的批次效应,将12套数据集合并为一个完整的AD芯片表达谱。利用R包“Limma”,通过差异分析获得了在AD中的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,然后使用R包“cluster Profiler”对DEGs进行GO和KEGG功能富注释和富集分析。随后,在STRING数据库中获取了差异表达基因编码蛋白互作信息,构建了蛋白-蛋白互作网络（protein-protein interaction network,PPI network）,并利用cytoscape软件分析、识别PPI网络中的核心驱动基因。趋同功能基因组学排序分析（Convergent functional genomic ranks,CFG）用以进一步筛选、分析与AD发生发展相关的核心驱动基因,进一步使用标准ROC（Receiver operating characteristic）曲线评估AD核心驱动基因作为AD潜在生物标志物的预测能力,同时利用AD芯片表达谱和人类阿尔兹海默病单细胞图谱数据库分析AD核心驱动基因在AD和正常组织以及神经细胞中的表达水平。2)基于分子对接法靶向h ErbB4虚拟筛选小分子化合物对AD潜在的治疗作用:靶向h ErbB4蛋白胞外功能结构域进行虚拟筛选,通过计算机分子对接手段判断小分子化合物和靶蛋白h ErbB4的结合能力,筛选出结合能力最强的前三个小分子化合物。随后使用神经元细胞HT22和NSC34作为实验对象,研究小分子化合物对神经元细胞增殖影响,同时利用蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）和细胞免疫荧光法（Immunofluorescence staining,IF）分析小分子化合物对神经元细胞ErbB4相关信号通路的影响,以及与Aβ1-42联合给药,研究在AD病理条件下小分子化合物对神经元细胞ErbB4相关信号通路的影响。结果1)基于AD芯片表达谱,通过差异表达分析一共识别了260个DEGs,包括79个上调基因和181个下调基因。2)功能富集分析结果显示,260个DEGs主要参与的GO生物学过程有细胞信号、转运调控和突触信号等,主要涉及的GO细胞组分包括突触,神经元投射和神经元体树突区等,GO分子功能主要包括转运蛋白活性、离子跨膜转运蛋白活性以及脂质结合,主要参与的KEGG信号通路有神经活性配体受体相互作用和突触囊泡循环等信号通路。3)利用Cytoscape软件在PPI网络中根据6种算法一共筛选识别了54个核心驱动基因,包括6个上调基因和48个下调基因。4)结合CFG排序分析结果和ROC曲线分析结果,筛选出了10个关键核心驱动基因,分别是ENO2（CFG=3,AUC=0.70）、GABRG2（CFG=4,AUC=0.71）、GAP43（CFG=3,AUC=0.69）、GFAP（CFG=3,AUC=0.71）、INA（CFG=3,AUC=0.72）、NRXN3（CFG=3,AUC=0.72）、RPH3A（CFG=4,AUC=0.71）、STXBP1（CFG=4,AUC=0.68）、SYT1（CFG=3,AUC=0.71）和UCHL1（CFG=3,AUC=0.68）。5)表达水平分析结果显示,10个关键核心驱动基因中GFAP在AD中高表达,在正常脑组织中低表达,其他9个基因（ENO2、GABRG2、GAP43、INA、NRXN3、RPH3A、STXBP1、SYT1和UCHL1）在AD中低表达,在正常脑组织中高表达。6)相关性分析结果显示,10个AD关键核心驱动基因中,GFAP与9个基因（ENO2、GABRG2、GAP43、INA、NRXN3、RPH3A、STXBP1、SYT1和UCHL1）的表达水平呈负相关,9个基因之间的表达水平呈正相关。7)单细胞结果分析显示,GFAP主要在星形胶质细胞（astrocyte）中大量表达,9个基因（ENO2、GABRG2、GAP43、INA、NRXN3、RPH3A、STXBP1、SYT1和UCHL1）主要在神经元（neuron）中大量表达,其中NRXN3和SYT1在神经元（neuron）中的表达水平最高。8)基于分子对接法,靶向h ErbB4虚拟筛选了3种结合能力最强的小分子化合物,包括C14H18F2N2O2、C16H15FN2O3和C18H22N4O2。9)分子对接结果显示,3种小分子化合物(C14H18F2N2O2、C16H15FN2O3和C18H22N4O2)都可以与h ErbB4形成三个氢键作用、一个π-π作用和多个疏水作用,具有较强的结合能力。10)细胞增殖实验结果显示,3种小分子化合物(C14H18F2N2O2、C16H15FN2O3和C18H22N4O2)可以促进神经元细胞HT22和NSC34的细胞增殖,但不同浓度处理（2 n M、5 n M和10 n M）对细胞增殖的促进作用无明显差异,且处理48 h后,小分子化合物仍然能够促进HT22和NSC34细胞的增殖。11)WB分析结果显示,3种小分子化合物(C14H18F2N2O2、C16H15FN2O3和C18H22N4O2)可显著促进HT22和NSC34细胞ErbB2和ErbB4受体磷酸化激活,10 n M的小分子化合物对HT22和NSC34细胞ErbB2和ErbB4受体磷酸化激活的促进作用最强。12)IF分析结果显示,3种小分子化合物(C14H18F2N2O2、C16H15FN2O3和C18H22N4O2)可显著促进HT22和NSC34细胞ErbB4受体磷酸化激活,10 n M的小分子化合物对HT22和NSC34细胞ErbB4受体磷酸化激活的促进作用最强。13)WB分析结果显示,3种小分子化合物(C14H18F2N2O2、C16H15FN2O3和C18H22N4O2)可显著促进HT22和NSC34细胞Akt和Erk1/2磷酸化激活。14)WB分析结果显示,3种小分子化合物(C14H18F2N2O2、C16H15FN2O3和C18H22N4O2)可显著提高HT22和NSC34细胞SYT1和GAP43蛋白表达水平,10 n M的小分子化合物对HT22和NSC34细胞SYT1和GAP43蛋白表达的促进作用最强。15)WB分析结果显示,Aβ1-42给药处理后显著降低了HT22和NSC34细胞ErbB2和ErbB4受体磷酸化水平,但提高了HT22和NSC34细胞ErbB2和ErbB4的蛋白表达水平。3种小分子化合物(C14H18F2N2O2、C16H15FN2O3和C18H22N4O2)可以显著促进Aβ1-42处理后的HT22和NSC34细胞ErbB2和ErbB4受体磷酸化激活。16)WB分析结果显示,Aβ1-42给药处理后显著降低了HT22和NSC34细胞SYT1和GAP43蛋白的表达水平,3种小分子化合物(C14H18F2N2O2、C16H15FN2O3和C18H22N4O2)都可以显著促进Aβ1-42处理后的HT22和NSC34细胞SYT1和GAP43蛋白的表达水平。结论1)AD的发病机制十分复杂,其潜在的分子机制尚不完全清楚。我们利用生物信息学分析方法,结合AD芯片表达谱,筛选鉴定出了10个与AD发生发展相关的核心驱动基因,其中GFAP在AD中高表达,主要表达在星形胶质细胞（astrocyte）中,ENO2、GABRG2、GAP43、INA、NRXN3、RPH3A、STXBP1、SYT1和UCHL1在AD中低表达,主要表达在神经元（neuron）中。同时,10个核心驱动基因可以作为AD潜在的生物标志物,与AD的病理发展具有显著的相关性,在AD的疾病发生发展过程中起着重要作用。2)虚拟筛选结果显示,靶向h ErbB4蛋白虚拟筛选的3种小分子化合物(C14H18F2N2O2、C16H15FN2O3和C18H22N4O2)可以显著促进HT22和NSC34细胞增殖,同时可通过促进HT22和NSC34细胞ErbB2和ErbB4受体磷酸化激活而促进Akt以及Erk1/2信号磷酸化激活,同时提高HT22和NSC34细胞SYT1和GAP43蛋白的表达水平。此外,在Aβ1-42给药处理下,分别给予3种小分子化合物(C14H18F2N2O2、C16H15FN2O3和C18H22N4O2)可显著促进HT22和NSC34细胞ErbB2和ErbB4受体磷酸化激活并提高SYT1和GAP43蛋白的表达水平,表明3种小分子化合物可以作为ErbB4受体有效的激动剂,促进其磷酸化激活,从而参与调控ErbB受体下游Akt和Erk1/2信号磷酸化水平以及SYT1和GAP43信号激活。体外研究结果提示三种小分子化合物对AD具有潜在的治疗作用,可以为未来AD的治疗药物研发提供新的思路。