【摘 要】
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目前,化疗药物基因纳米共递送体系面临缺乏肿瘤靶向性、血液循环时间短、细胞摄取差和转染效率低等问题。迫切需要开发安全高效的主动靶向纳米共递送系统。靶向配体能赋予纳米系统良好的肿瘤靶向性,开发基于靶向配体的纳米共递送体系已成为解决问题的重要手段。乳糖酸作为一种主动靶向肝癌细胞的天然特异性配体,被广泛用于构建肝癌靶向的纳米载体,而且作为一种常用的稳定剂,能提高纳米体系的稳定性。因此有望通过探索乳糖酸的接
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目前,化疗药物基因纳米共递送体系面临缺乏肿瘤靶向性、血液循环时间短、细胞摄取差和转染效率低等问题。迫切需要开发安全高效的主动靶向纳米共递送系统。靶向配体能赋予纳米系统良好的肿瘤靶向性,开发基于靶向配体的纳米共递送体系已成为解决问题的重要手段。乳糖酸作为一种主动靶向肝癌细胞的天然特异性配体,被广泛用于构建肝癌靶向的纳米载体,而且作为一种常用的稳定剂,能提高纳米体系的稳定性。因此有望通过探索乳糖酸的接枝率对主动纳米递送系统整体性能,如稳定性、转染效率及抗肝癌作用等的影响规律,从而构建安全、稳定、高效的药物基因主动靶向纳米共递送系统。本课题拟通过改变乳糖酸的投料量来合成不同乳糖酸接枝率的半乳糖化壳聚糖-氟尿嘧啶（GC-FUA）,以不同乳糖酸接枝率的GCFUA包载LHPP质粒构建主动靶向的药物基因共递送纳米体系（GCFUA/LHPP）,从稳定性、体外转染效率、体外抗肝癌效果等方面来考察主动靶向配体乳糖酸的接枝率对整个主动靶向药物基因共递送体系的影响。首先合成了三种不同乳糖酸（LA）接枝率的半乳糖化壳聚糖氟尿嘧啶大分子前药（GC-FUA）并对其进行理化性质表征。通过酰胺缩合反应、改变LA的投料量合成三种不同LA接枝率的半乳糖化壳聚糖（GC）,再将氟尿嘧啶（FUA）键合到GC上合成三种GC-FUA。采用红外光谱与核磁共振氢谱验证GC、FUA、GC-FUA的化学结构,以核磁共振氢谱计算LA接枝率分别为34.9%（GC-FUA-1）、52.5%（GC-FUA-2）和71.7%（GC-FUA-3）。通过离子交联法构建GC-FUA纳米体系,三种GC-FUA纳米粒的平均纳米粒径呈正态单峰分布、保持在150 nm左右,Zeta电位呈正电位、保持在10 m V左右。然后以三种不同LA接枝率的GC-FUA纳米粒为载体包载LHPP质粒构建纳米复合物,对三种纳米复合物进行处方优化,并进行物理化学性质表征。通过复凝集法成功构建三种GC-FUA/LHPP纳米复合物,平均纳米粒径分别为:154.5±8.8 nm（GC-FUA-1/LHPP）,156.9±6.4nm（GC-FUA-2/LHPP）,157.5±15.3 nm（GC-FUA-3/LHPP）。琼脂糖凝胶电泳考察三种纳米复合物的DNA结合能力,三种纳米复合物均能有效包载LHPP质粒。透射电镜下三种纳米复合物呈较均一、规则的球形。随着LA接枝率的增加,纳米复合物的稳定性如稀释、介质、放置稳定性也得到提高。核酸酶保护实验、血清保护实验证明三种纳米复合物都具有较强的核酸保护能力。三种GC-FUA/LHPP纳米复合物的溶血率都低于5%且具有较好的血液相容性。随后以人肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7402细胞为模型进行三种GC-FUA/LHPP纳米复合物的体外转染评价。首先通过蛋白免疫印迹法考察三种肝癌细胞中LHPP蛋白量的表达,并采用流式细胞术评价对三种GC-FUA/LHPP纳米复合物的摄取能力,人肝癌BEL-7402细胞中表达最低,且人肝癌BEL-7402细胞对三种纳米复合物的摄取最高。因此以人肝癌细胞BEL-7402为模型,采用流式细胞术及倒置荧光显微镜检测三种GC-FUA/LHPP纳米复合物体外转染效率,随着LA接枝率的增加,纳米复合物的稳定性提高、靶向能力增强使得其体外转染效率提高、LHPP蛋白的表达量增加。最后利用人肝癌BEL-7402细胞为模型对三种GC-FUA/LHPP纳米复合物进行体外药效学研究。MTT及Ed U、划痕实验显示,随着LA接枝率的增加,稳定性提高能减少入胞过程中LHPP的降解、增加其入胞量,靶向能力增强可提高LHPP转染效率,综合两者使得其抑制细胞增殖、细胞迁移能力增强。流式细胞术测定脂质过氧化物（LPO）的积累考察三种GC-FUA/LHPP纳米复合物诱导肝癌铁死亡的效果,发现纳米复合物的转染效率随着LA接枝率的增加而提高,导致LPO的积累增加、诱导肝癌细胞铁死亡的效果增强。以上所有结果表明,三种GC-FUA/LHPP纳米复合物都具有良好的体外抗肿瘤作用,且随着LA接枝率的增加,纳米复合物的体外抗肿瘤作用增强。本课题首次阐明了主动靶向配体乳糖酸的接枝率对药物基因纳米共递送体系整体性能变化规律的影响,发现随着乳糖酸接枝率的增加,共递送纳米体系的稳定性、体外转染效率以及体外抗肝癌效果随之提高。本课题为基于乳糖酸的主动靶向药物基因纳米共递送体系的设计提供了制剂思路。
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