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在生理情况下，体内凝血系统和抗凝血系统的动态平衡维持着机体正常的血液流动。其中抗凝血酶（Antithrombin，AT）是机体抗凝系统中最重要的抗凝物质，AT通过灭活活化的凝血因子Ⅱ（activated coagulation factorⅡ，FⅡa）、活化的凝血因子Ⅸ（activated coagulation factorⅨ，FⅨa）、活化的凝血因子Ⅹ（activated coagulation factorⅩ，FⅩa）、活化的凝血因子Ⅺ（activated coagulation factorⅪ，FⅪa）和活化的凝血因子Ⅻ（activated coagulation factorⅫ，FⅫa）发挥其抗凝血作用。AT的抗凝活性在肝素存在下可增强2000倍，这是肝素被广泛用作抗凝血剂的原因。遗传性抗凝血酶缺陷症（hereditary antithrombin deficiency）、遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症（hereditary FⅦdeficiency）和遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症（hereditary FⅫdeficiency）因编码相应蛋白的SERPINC1基因、F7基因和F12基因突变所致机体抗凝血系统或凝血系统异常的疾病。若这两个系统出现异常则会对机体造成不同程度的影响，因此对该类疾病的表型和基因型变异进行研究，有助于了解此类疾病的发病机制，帮助临床诊断、治疗及预防疾病。本研究对一个遗传性抗凝血酶与凝血因子Ⅶ联合缺陷症家系和一个遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症家系进行表型诊断和基因型分析，初步探讨其发病的分子遗传学基础。
目的：
对一个遗传性抗凝血酶与凝血因子Ⅶ联合缺陷症家系和一个遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症家系的家庭成员进行表型检测及基因型分析，并使用生物信息学技术对突变基因进行分析，初步探讨其分子致病机制。
方法：
1.先证者及家系病史采集：
1.1.先证者1是一名33岁的中国女性，此次因“突发左下肢肿胀伴疼痛”入院。患者2天前睡醒后发现左下肢肿胀，伴左大腿局部疼痛。B型超声检查结果为左侧髂外静脉、股总静脉、股深静脉及大隐静脉起始段多发血栓形成。凝血因子检测显示抗凝血酶活性（antithrombin activity，AT:A）为46%明显降低，凝血因子Ⅶ活性（coagulation factorⅦactivity，FⅦ:C）在正常范围，为112%。临床诊断为“左下肢深静脉血栓形成，试管婴儿（in vitro fertilization，IVF）妊娠状态，抗凝血酶缺陷症”。先证者1家系共3代16人，先证者及其堂姐、表姐均有血栓形成史。
1.2.先证者2是一名50岁的中国男性，此次因“右肱骨创伤性骨折”入院。先证者无异常出血或血栓形成病史。术前常规检查发现活化部分凝血活酶时间（Activated Partial Thromboplastin Time，APTT）延长，为59.1s/36.0s，进一步检测凝血因子显示FⅫ活性（coagulation factorⅫactivity，FⅫ:C）和FⅫ抗原（antithrombin antigen，FⅫ:Ag）均明显降低，分别为4％和5％。先证者被诊断为“右肱骨骨折，Ⅰ型FⅫ缺陷症”。先证者2家系共3代5人，除先证者妻子FⅫ活性正常外，其他家系成员FⅫ活性均存在不同程度的降低。
2.实验室检测：收集两名先证者及其家系成员的外周静脉血，用枸橼酸钠抗凝后离心，在全自动血凝仪上采用凝固法测定APTT、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、凝血酶时间（thrombin time，TT）、纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）、FⅦ:C、FⅫ:C和蛋白S活性（protein S activity，PS:A）；发色底物法检测AT:A和蛋白C活性（protein C activity，PC:A）；酶联免疫吸附试验法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测抗凝血酶抗原（antithrombin antigen，AT:Ag）、凝血因子Ⅶ抗原（coagulation factor FⅦantigen，FⅦ:Ag）和FⅫ:Ag水平。
3.基因型检测：用非离心柱型基因组DNA提取方法提取两名先证者及其家庭成员的外周血基因组DNA；设计引物，聚合酶链式反应（Polymerase chain eaction，PCR）扩增SERPINC1，F7和F12基因所有外显子和侧翼序列，以及3’、5’端非编码区。纯化后的扩增产物送至上海桑尼公司测序，然后与美国国立生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）提供的SERPINC1基因（GenBank X68793）、F7基因（GenBank GI180333）和F12基因（GenBank AF538691）序列进行比对，寻找突变位点，若发现突变位点，则反向测序予以确认。
4.数据处理分析：利用ClustalX-2.1-win软件分析基因突变位点的保守性；应用MutationTaster、PROVEAN和SIFT三个在线生物信息学软件分析碱基突变后对整个蛋白质功能的影响；同时用Swiss-pdbViewer-4.01和Pymol软件，根据蛋白数据库（Protein database，PDB）提供的野生FⅦ和FⅫ蛋白三维结构模型，构建突变蛋白模型，分析突变前后蛋白质空间结构及分子间作用力的改变。
结果：
1.先证者1的AT:A降低至46%，AT:Ag含量为135mg/L；测序结果发现SERPINC1基因的5’非编码区（5’UTR）存在罕见的rs3138521多态性。先证者父亲、小姑、堂姐、表姐、小弟弟和侄子SERPINC1基因5’UTR也存在rs3138521多态性，其AT:A和AT:Ag均降低至正常值的50%左右；先证者父亲、小姑、大弟弟、小弟弟和侄子F7基因8号外显子存在杂合错义突变c.1091G＞A（p.Arg304Gln），上述家庭成员FⅦ:C均降低至正常值的50%左右，而FⅦ:Ag含量正常。家系其他成员SERPINC1基因与F7基因均为野生型。
2.先证者2的FⅫ:C和FⅫ:Ag均明显降低，分别为4%和5%；测序结果发现F12基因的13号外显子存在c.1561G＞A（p.Glu502Lys）、c.1637T＞C（p.Met527Thr）双杂合错义突变。先证者的父亲、母亲和女儿分别携带c.1637T＞C、c.1561G＞A、c.1561G＞A杂合错义点突变，其FⅫ:C和FⅫ:Ag均降低至正常水平的30%左右。
3.ClustalX-2.1-win软件分析结果表明，F7基因的Arg304及F12基因的Glu502、Met527氨基酸残基在同源物种间均高度保守。MutationTaster生物学软件预测F7基因的p.Arg304Gln为有害突变；MutationTaster、PROVEAN和SIFT三个生物学软件预测F12基因的p.Glu502Lys、p.Met527Thr均为有害突变，能影响相应蛋白的功能。FⅦ蛋白模型分析显示，突变前Arg304和Arg276形成一个氢键；当带正电荷的碱性氨基酸Arg304被极性亲水不带电荷的Gln304取代后，除了与Arg276形成一个氢键外，还与His341新生成两个氢键。FⅫ蛋白模型分析显示，在野生型FⅫ蛋白质中，Glu502残基与His365存在一个氢键；突变型Lys502与His365形成的氢键消失。对于p.Met527Thr，Met527残基与Leu524存在一个氢键；突变型Thr527与Leu524原先形成的氢键并没有改变，但与Leu524新生成两个氢键。
结论：
1.遗传性抗凝血酶与凝血因子Ⅶ联合缺陷症家系先证者AT:A与AT:Ag含量均降低，为Ⅰ型抗凝血酶缺陷症；先证者SERPINC1基因的5’UTR存在罕见的rs3138521多态性与该家系AT水平降低有关。部分家系成员FⅦ:C降低至正常值的50%左右，而FⅦ:Ag含量正常，为Ⅱ型FⅦ缺陷症；其F7基因8号外显子存在c.1091G＞A杂合错义突变，导致p.Arg304Gln，此突变与该家系FⅦ水平降低有关。
2.遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症家系先证者FⅫ:C与FⅫ:Ag含量均降低，为Ⅰ型FⅫ缺陷症；先证者F12基因的13号外显子存在c.1561G＞A、c.1637T＞C双杂合错义突变，导致p.Glu502Lys、p.Met527Thr。该双杂合错义突变与该家系FⅫ水平降低有关。
3.遗传性抗凝血酶与凝血因子Ⅶ联合缺陷症和遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症的p.Met527Thr错义突变均为国内外鲜见报道。
目的：
对一个遗传性抗凝血酶与凝血因子Ⅶ联合缺陷症家系和一个遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症家系的家庭成员进行表型检测及基因型分析，并使用生物信息学技术对突变基因进行分析，初步探讨其分子致病机制。
方法：
1.先证者及家系病史采集：
1.1.先证者1是一名33岁的中国女性，此次因“突发左下肢肿胀伴疼痛”入院。患者2天前睡醒后发现左下肢肿胀，伴左大腿局部疼痛。B型超声检查结果为左侧髂外静脉、股总静脉、股深静脉及大隐静脉起始段多发血栓形成。凝血因子检测显示抗凝血酶活性（antithrombin activity，AT:A）为46%明显降低，凝血因子Ⅶ活性（coagulation factorⅦactivity，FⅦ:C）在正常范围，为112%。临床诊断为“左下肢深静脉血栓形成，试管婴儿（in vitro fertilization，IVF）妊娠状态，抗凝血酶缺陷症”。先证者1家系共3代16人，先证者及其堂姐、表姐均有血栓形成史。
1.2.先证者2是一名50岁的中国男性，此次因“右肱骨创伤性骨折”入院。先证者无异常出血或血栓形成病史。术前常规检查发现活化部分凝血活酶时间（Activated Partial Thromboplastin Time，APTT）延长，为59.1s/36.0s，进一步检测凝血因子显示FⅫ活性（coagulation factorⅫactivity，FⅫ:C）和FⅫ抗原（antithrombin antigen，FⅫ:Ag）均明显降低，分别为4％和5％。先证者被诊断为“右肱骨骨折，Ⅰ型FⅫ缺陷症”。先证者2家系共3代5人，除先证者妻子FⅫ活性正常外，其他家系成员FⅫ活性均存在不同程度的降低。
2.实验室检测：收集两名先证者及其家系成员的外周静脉血，用枸橼酸钠抗凝后离心，在全自动血凝仪上采用凝固法测定APTT、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、凝血酶时间（thrombin time，TT）、纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）、FⅦ:C、FⅫ:C和蛋白S活性（protein S activity，PS:A）；发色底物法检测AT:A和蛋白C活性（protein C activity，PC:A）；酶联免疫吸附试验法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测抗凝血酶抗原（antithrombin antigen，AT:Ag）、凝血因子Ⅶ抗原（coagulation factor FⅦantigen，FⅦ:Ag）和FⅫ:Ag水平。
3.基因型检测：用非离心柱型基因组DNA提取方法提取两名先证者及其家庭成员的外周血基因组DNA；设计引物，聚合酶链式反应（Polymerase chain eaction，PCR）扩增SERPINC1，F7和F12基因所有外显子和侧翼序列，以及3’、5’端非编码区。纯化后的扩增产物送至上海桑尼公司测序，然后与美国国立生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）提供的SERPINC1基因（GenBank X68793）、F7基因（GenBank GI180333）和F12基因（GenBank AF538691）序列进行比对，寻找突变位点，若发现突变位点，则反向测序予以确认。
4.数据处理分析：利用ClustalX-2.1-win软件分析基因突变位点的保守性；应用MutationTaster、PROVEAN和SIFT三个在线生物信息学软件分析碱基突变后对整个蛋白质功能的影响；同时用Swiss-pdbViewer-4.01和Pymol软件，根据蛋白数据库（Protein database，PDB）提供的野生FⅦ和FⅫ蛋白三维结构模型，构建突变蛋白模型，分析突变前后蛋白质空间结构及分子间作用力的改变。
结果：
1.先证者1的AT:A降低至46%，AT:Ag含量为135mg/L；测序结果发现SERPINC1基因的5’非编码区（5’UTR）存在罕见的rs3138521多态性。先证者父亲、小姑、堂姐、表姐、小弟弟和侄子SERPINC1基因5’UTR也存在rs3138521多态性，其AT:A和AT:Ag均降低至正常值的50%左右；先证者父亲、小姑、大弟弟、小弟弟和侄子F7基因8号外显子存在杂合错义突变c.1091G＞A（p.Arg304Gln），上述家庭成员FⅦ:C均降低至正常值的50%左右，而FⅦ:Ag含量正常。家系其他成员SERPINC1基因与F7基因均为野生型。
2.先证者2的FⅫ:C和FⅫ:Ag均明显降低，分别为4%和5%；测序结果发现F12基因的13号外显子存在c.1561G＞A（p.Glu502Lys）、c.1637T＞C（p.Met527Thr）双杂合错义突变。先证者的父亲、母亲和女儿分别携带c.1637T＞C、c.1561G＞A、c.1561G＞A杂合错义点突变，其FⅫ:C和FⅫ:Ag均降低至正常水平的30%左右。
3.ClustalX-2.1-win软件分析结果表明，F7基因的Arg304及F12基因的Glu502、Met527氨基酸残基在同源物种间均高度保守。MutationTaster生物学软件预测F7基因的p.Arg304Gln为有害突变；MutationTaster、PROVEAN和SIFT三个生物学软件预测F12基因的p.Glu502Lys、p.Met527Thr均为有害突变，能影响相应蛋白的功能。FⅦ蛋白模型分析显示，突变前Arg304和Arg276形成一个氢键；当带正电荷的碱性氨基酸Arg304被极性亲水不带电荷的Gln304取代后，除了与Arg276形成一个氢键外，还与His341新生成两个氢键。FⅫ蛋白模型分析显示，在野生型FⅫ蛋白质中，Glu502残基与His365存在一个氢键；突变型Lys502与His365形成的氢键消失。对于p.Met527Thr，Met527残基与Leu524存在一个氢键；突变型Thr527与Leu524原先形成的氢键并没有改变，但与Leu524新生成两个氢键。
结论：
1.遗传性抗凝血酶与凝血因子Ⅶ联合缺陷症家系先证者AT:A与AT:Ag含量均降低，为Ⅰ型抗凝血酶缺陷症；先证者SERPINC1基因的5’UTR存在罕见的rs3138521多态性与该家系AT水平降低有关。部分家系成员FⅦ:C降低至正常值的50%左右，而FⅦ:Ag含量正常，为Ⅱ型FⅦ缺陷症；其F7基因8号外显子存在c.1091G＞A杂合错义突变，导致p.Arg304Gln，此突变与该家系FⅦ水平降低有关。
2.遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症家系先证者FⅫ:C与FⅫ:Ag含量均降低，为Ⅰ型FⅫ缺陷症；先证者F12基因的13号外显子存在c.1561G＞A、c.1637T＞C双杂合错义突变，导致p.Glu502Lys、p.Met527Thr。该双杂合错义突变与该家系FⅫ水平降低有关。
3.遗传性抗凝血酶与凝血因子Ⅶ联合缺陷症和遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症的p.Met527Thr错义突变均为国内外鲜见报道。