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目的采用miRNA表达谱芯片技术,筛选出肾阳虚证及右归丸治疗前后差异表达的miRNAs,通过对差异表达的miRNAs靶基因预测及功能分析,从miRNA基因转录后调控角度初步探讨肾阳虚证的分子机制及右归丸的修复作用。方法1.以中国知网为平台、肾阳虚证为主要关键词进行检索,并结合中医经典书籍研究传统医学对本证的认识。关于miRNA的研究则主要通过PubMed、Geenmedical等外文文献数据库检索,进行理论研究。2.运用基因芯片技术筛选差异表达miRNAs:根据肾阳虚证的辨证标准选择试验对象,抽取外周静脉血提取总RNA,进行样品标记和基因芯片杂交。采用倍数分析法,以Fold change≧2或Fold change≦0.5,且P-value<0.05为筛选条件,分别筛选健康对照组、肾阳虚证组和右归丸治疗组差异表达miRNAs。将三组差异表达miRNAs两两比较,分别筛选出组间相对差异表达的miRNAs。3.肾阳虚证相关miRNA的筛选原理:肾阳虚证组和正常对照组比较获取肾阳虚证相关差异表达miRNAs,经右归丸治疗后筛选该批差异表达miRNAs表达是否出现显著性变化,治疗后有显著差异表达的miRNAs可被认为与肾阳虚证密切相关。利用韦恩图筛选与肾阳虚证密切相关的miRNAs。4.运用TargetScanHuman7.2、miRDB、miRTarbase三个数据库对肾阳虚证密切相关的miRNAs进行靶基因预测,利用DAVID软件进行靶基因GO富集和KEGG通路分析。5.对miRNA表达谱芯片分析结果进行验证:通过筛选得出意义较大的miRNAs进行实时定量PCR检测,并分析验证结果与基因芯片结果是否一致。结果1.运用基因芯片技术筛选差异表达miRNAs,其中肾阳虚证组与健康对照组差异miRNAs共46条,其中28条表达上调,18条表达下调;肾阳虚证组与右归丸治疗组差异miRNAs共433条,其中149条表达上调,284条表达下调;右归丸治疗组与健康对照组差异miRNAs共429条,其中160条表达上调,269条表达下调。2.根据肾阳虚证相关miRNA的筛选原理,共筛选出19条与肾阳虚证关系密切的差异表达miRNAs。将这19条miRNAs在TargetScanHuman7.2、miRDB、miRTarbase中预测所得的靶基因取交集,共筛选出14条具有共同靶基因的miRNAs。3.利用DIVID软件将其所有共同的靶基因进行GO富集和KEGG通路分析,发现靶基因功能主要包括3类:免疫调节、细胞周期调控和代谢调节。基于miRNA对其靶基因的负调控作用,通过各功能类靶基因与miRNAs靶基因反向取交集,结果提示miR-214-3p功能与免疫调节相关;miR-5009-3p、miR-3658、miR-214-3p和miR-4795-5p功能与细胞周期调控相关;miR-1205、miR-214-3p、miR-3658功能与代谢调节相关。4.芯片结果的实时定量PCR验证结果发现,miR-214-3p在肾阳虚证中出现差异表达。结论1.miRNA参与肾阳虚证的调控,miRNA对肾阳虚证的调控作用是广泛的,主要涉及免疫调节、细胞周期调控和代谢调节3个方面,而右归丸可通过改变这些特征miRNA的表达起到对该证的调控作用。2.在肾阳虚证及右归丸疗效相关差异表达miRNA中,miR-214-3p显著表达,其在肾阳虚证中的作用有待进一步深入研究。