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胃肠肿瘤是临床高发的消化道恶性肿瘤，且近些年发病率和死亡率呈现明显增长态势，尽管随着治疗理念的不断进步和手术、化疗、靶向药物治疗、生物免疫治疗等治疗方案的普及应用，胃肠肿瘤患者的预后转归得到了部分改善，但仍有一部分患者的临床治疗效果较差，因此寻找胃肠癌更为特异和敏感的治疗靶点，研制新型靶向药物成为当前胃肠癌治疗的研究要点。
动粒是连接姐妹染色体纺锤体微丝的重要蛋白质网络，主要由内部CCAN蛋白质网络和外部KMN蛋白质网络构成，在有丝分裂期间逐步转移、组装至染色体上。KMN蛋白网络主要由KNL1，Mis12复合物及NDC80复合物组成。动粒支架1(Kinetochore scaffold 1，KNL1)是KMN网络复合基因家族的重要成员。蛋白甲基转移酶6(Methyltransferase SET domain containing protein 6，SETD6)主要由i-SET的螺旋结构和C-末端结构域组成，主要由α螺旋和一些β链组成。miRNA是具有18至24个核苷酸长度的内源RNA，其可主要通过结合3-非翻译区(3-UTR)来调节靶基因表达。目前研究证实，致癌基因和肿瘤抑制基因均受miRNA调控，miRNA在人类癌症发生发展中扮演着至关重要的角色。通过TargetScan和miRDB分析，KNL1和SETD6均为miR-498的靶基因。以往的研究表明，KNL1和SETD6与人类许多恶性肿瘤的发生、进展以及预后转归密切相关。
目前，关于KNL1、SETD6在胃肠肿瘤中表达的研究以及其临床价值探究相对比较少，鉴于其临床价值较高，故通过研究证实KNL1和SETD6基因在胃肠肿瘤中的表达水平与对应正常组织是否存在差异，深入探究其与胃肠肿瘤患者预后转归之间的关系具有重要的临床意义。本研究通过应用免疫组织化学法检测人结直肠癌组织中KNL1和SETD6蛋白的表达情况及其临床意义，应用RT-qPCR检测人结直肠癌组织中KNL1的mRNA表达水平，应用Westernblot检测人结直肠癌组织中KNL1蛋白和胃癌组织中SETD6和KNL1的表达水平，基于表达水平的差异、靶向基因的定位、质粒构建技术、PCR技术等构建了可特异性抑制KNL1基因表达的慢病毒shRNA载体，并通过观察其基因沉默的效果，构建沉默KNL1基因的人结肠腺癌细胞株，同时观察、评价KNL1对人结肠腺癌细胞增殖和凋亡的影响。
第一部分KNL1、SETD6在胃肠肿瘤中的表达及临床意义
目的：探讨人结直肠癌组织及对应的癌旁正常组织中KNL1的mRNA和蛋白表达与SETD6蛋白表达水平的差异，研究人胃癌组织及对应的癌旁正常组织中SETD6、KNL1蛋白表达水平的差异，并将KNL1蛋白的表达水平与结直肠癌患者的临床病理参数、预后以及与SETD6蛋白表达水平进行相关性分析。
方法：
1采用免疫组织化学的方法检测108例人结直肠癌组织标本中KNL1和SETD6蛋白的表达情况；评价KNL1蛋白在人结直肠癌组织标本中的表达情况与临床病理特征之间的关系；采用统计方法分析人结直肠癌组织标本中KNL1蛋白与结直肠癌患者生存期之间的关系。采用统计方法分析人结直肠癌组织标本中KNL1蛋白与SETD6蛋白表达之间的关系。
2应用RT-qPCR检测人结直肠癌组织标本中KNL1的mRNA表达水平；应用Westernblot检测人结直肠癌组织标本中KNL1蛋白的表达水平；应用Westernblot检测人胃癌组织标本中SETD6、KNL1蛋白的表达水平。
3经过电话回访、门诊随访等不同方式了解108例结直肠癌患者的生存情况。收集结直肠癌患者完整的临床信息，包括患者的肿瘤分化程度、性别、年龄、临床分期、肿瘤部位、肿瘤浸润深度和淋巴结转移等信息资料，并对这些信息资料进行统计和分析。
4免疫组织化学结果的评估由两名资深的病理医师采用双盲方法各自独立进行。结直肠癌细胞的染色强度分为4个等级，其中0表示没有癌细胞染色，1表示弱染色，2表示中度染色，3表示强染色。此外，染色的癌细胞百分比也分成4个等级，其中0表示无，1表示＜10％，2表示10-50％，3表示＞50％。此外，用强度等级评分乘以染色等级百分比评分得到平均的总分。计算分析108个结直肠肿瘤的KNL1和SETD6免疫组化的平均分为4.9和5.4。因此，选择4.9和5.4分作为截止点，以区分KNL1和SETD6的表达状态。其中，得分＞4.9和＞5.4的样品为KNL1和SETD6阳性表达，得分≤4.9和≤5.4的样品为KNL1和SETD6阴性表达。
结果：
1KNL1、SETD6在癌旁正常组织及胃肠肿瘤组织中的表达情况
RT-qPCR结果显示，与对应的癌旁正常组织相比，结直肠癌组织中KNL1的mRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；Westernblot结果显示，与对应的癌旁正常组织相比，结直肠癌组织中KNL1蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，与对应的癌旁正常组织相比，胃癌组织中SETD6和KNL1蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；免疫组织化学结果示，108例结直肠癌患者中75(69.4%)例癌组织中KNL1蛋白表达高于其对应的癌旁正常组织，33(30.6%)例癌组织中KNL1蛋白表达与其对应的癌旁正常组织相比，无明显差异或表达下调；108例结直肠癌患者中70(64.8%)例癌组织中SETD6蛋白表达高于其对应的癌旁正常组织，38(35.2%)例癌组织中SETD6蛋白表达与其对应的癌旁正常组织相比，无明显差异或表达下调；免疫组织化学结果显示，KNL1和SETD6在结直肠癌组织中阳性表达分别为75例和70例，阳性表达率69.4%和64.8%，阳性表达主要定位在细胞核中。
2KNL1与结直肠癌患者各临床病理参数之间的关系
KNL1蛋白的表达水平与结直肠癌患者的性别、年龄、临床分期、肿瘤部位、肿瘤浸润深度和淋巴结转移均无明显相关性(P＞0.05)，但与肿瘤分化程度有显著相关性(P＜0.05)。
3KNL1与结直肠癌患者5年生存率的关系
KNL1阳性表达的患者中位生存时间为35个月，KNL1阴性表达的患者中位生存时间为50个月，两者比较有显著差异，KNL1阳性表达患者的预后劣于KNL1阴性表达的患者(P=0.010)。
4KNL1与SETD6蛋白表达的关系
KNL1蛋白的表达与SETD6蛋白的表达存在显著相关性(P＜0.0001)。
结论：结直肠癌组织中KNL1的mRNA、蛋白和SETD6的蛋白表达上调，结直肠癌组织中的KNL1阳性表达与肿瘤分化程度相关。胃癌组织中SETD6、KNL1的蛋白表达上调。KNL1阳性表达患者的预后劣于KNL1阴性表达的患者。KNL1与SETD6蛋白的表达存在显著相关性。
第二部分KNL1基因沉默结肠腺癌细胞株的构建
目的：通过对靶标KNL1基因短发夹结构RNA(shRNA)以及其慢病毒表达载体的构建，然后转染人结肠腺癌细胞，创建KNL1基因沉默的人结肠腺癌细胞株。
方法：
1运用基因查序的办法获取KNL1基因的靶标序列，然后衔接到GV115慢病毒载体，顺利得到携带KNL1基因的慢病毒shRNA载体。
2装配慢病毒，然后转染293T细胞，获取高滴度的慢病毒浓缩液，对慢病毒浓缩液进行病毒滴度的检测。
3应用RT-qPCR和WesternBlot技术方法检验目标基因的敲低效果，创立KNL1基因沉默的人结肠腺癌细胞株。
结果：
1成功构建的KNL1-shRNA干扰慢病毒载体通过鉴定测序，检测结果与目标基因序列完全相同，证明KNL1基因干扰慢病毒载体被成功的构建。
2应用荧光显微镜进行慢病毒滴度测量并结合稀释倍数得出病毒滴度，计算出慢病毒滴度为：
KNL1-shRNA的感染滴度约为1×108TU/mL。
3慢病毒感染细胞情况
控制慢病毒的感染滴度为1×108TU/mL时，按照1:5稀释实施感染，shKNL1病毒感染效率基本可以到达80%以上。
4shRNA慢病毒对人结肠腺癌细胞KNL1mRNA表达的影响
shKNL1组相对于阴性对照shCtrl组的KNL1mRNA表达水平明显降低(P＜0.05)。
5shRNA慢病毒对人结肠腺癌细胞KNL1蛋白表达的影响
阴性对照细胞shCtrl组和shKNL1组KNL1蛋白表达水平有显著差异，shKNL1组KNL1蛋白表达水平的灰度值有显著降低(P＜0.05)。
结论：运用RNA干扰手段成功地建立了KNL1基因沉默的人结肠腺癌细胞株，为后续实验提供了靶标细胞。
第三部分重组慢病毒GV115/KNL1shRNA对结肠癌细胞RKO和HT-29生物学功能的影响
目的：研究KNL1对人结肠腺癌细胞RKO和HT-29增殖和凋亡的影响，为临床通过调节结直肠癌KNL1蛋白水平抑制肿瘤的增殖提供理论依据。
方法：
1应用MTT、克隆形成检测各组细胞的增殖情况。
2应用Celigo细胞计数法检测各组细胞的生长情况。
3应用流式细胞检测法检测各组细胞的凋亡情况。
结果：
1沉默KNL1基因对细胞增殖的影响
shRNA-KNL1与空白对照组及阴性对照组在72h、96h、120h相比较，OD值均明显减小，差异有统计学意义(shRNA-KNL1组VS阴性对照组：P＜0.01)；(shRNA-KNL1组VS空白对照组：P＜0.01)。
2沉默KNL1基因对细胞生长的影响
shRNA-KNL1与空白对照组及阴性对照组在72h、96h、120h相比较，细胞数均明显减小，差异有统计学意义(shRNA-KNL1组VS阴性对照组：P＜0.01)；(shRNA-KNL1组VS空白对照组：P＜0.01)。
3沉默KNL1基因对细胞凋亡的影响
shRNA-KNL1、阴性对照组细胞凋亡率分别为(14.86±0.31)%、(4.32±0.14)%。shRNA-KNL1组与阴性对照组相比较凋亡率差异有统计学意义(shRNA-KNL1组VS阴性对照组：P＜0.01)。
结论：采用RNA干扰技术(质粒瞬时转染及慢病毒稳定转染)有效沉默KNL1基因后，能够明显抑制人结肠腺癌细胞RKO和HT-29的生长和增殖；并且沉默KNL1基因还可以促进人结肠腺癌细胞RKO的凋亡。
总结：
1人结直肠癌组织中KNL1的mRNA、蛋白和SETD6蛋白表达水平显著高于癌旁正常组织，蛋白主要定位于细胞核表达。胃癌组织中SETD6和KNL1的蛋白表达上调。KNL1蛋白的表达水平与结直肠癌患者的性别、年龄、临床分期、肿瘤部位、肿瘤浸润深度和淋巴结转移均无显著相关性，与肿瘤分化程度存在显著正相关。KNL1阳性表达患者的预后劣于KNL1阴性表达的患者。人结直肠癌组织中KNL1蛋白与SETD6蛋白表达存在显著相关性。提示KNL1可能是人结直肠腺癌不良预后的潜在肿瘤生物标志物。
2成功构建GV115/KNL1shRNA的慢病毒表达载体，成功制备高滴度的重组慢病毒GV115/KNL1shRNA，并能有效感染人结肠腺癌细胞株；重组慢病毒GV115/KNL1shRNA感染人结肠腺癌细胞株后，能显著抑制KNL1的mRNA表达和蛋白表达，成功地建立了KNL1基因沉默的人结肠腺癌细胞株，为下一步实验提供了实验靶细胞。
3重组慢病毒GV115/KNL1shRNA能有效抑制RKO和HT-29细胞的生长、增殖、克隆形成，促进RKO细胞凋亡，体外试验进一步表明KNL1可能是结直肠腺癌一个潜在的治疗靶点。
动粒是连接姐妹染色体纺锤体微丝的重要蛋白质网络，主要由内部CCAN蛋白质网络和外部KMN蛋白质网络构成，在有丝分裂期间逐步转移、组装至染色体上。KMN蛋白网络主要由KNL1，Mis12复合物及NDC80复合物组成。动粒支架1(Kinetochore scaffold 1，KNL1)是KMN网络复合基因家族的重要成员。蛋白甲基转移酶6(Methyltransferase SET domain containing protein 6，SETD6)主要由i-SET的螺旋结构和C-末端结构域组成，主要由α螺旋和一些β链组成。miRNA是具有18至24个核苷酸长度的内源RNA，其可主要通过结合3-非翻译区(3-UTR)来调节靶基因表达。目前研究证实，致癌基因和肿瘤抑制基因均受miRNA调控，miRNA在人类癌症发生发展中扮演着至关重要的角色。通过TargetScan和miRDB分析，KNL1和SETD6均为miR-498的靶基因。以往的研究表明，KNL1和SETD6与人类许多恶性肿瘤的发生、进展以及预后转归密切相关。
目前，关于KNL1、SETD6在胃肠肿瘤中表达的研究以及其临床价值探究相对比较少，鉴于其临床价值较高，故通过研究证实KNL1和SETD6基因在胃肠肿瘤中的表达水平与对应正常组织是否存在差异，深入探究其与胃肠肿瘤患者预后转归之间的关系具有重要的临床意义。本研究通过应用免疫组织化学法检测人结直肠癌组织中KNL1和SETD6蛋白的表达情况及其临床意义，应用RT-qPCR检测人结直肠癌组织中KNL1的mRNA表达水平，应用Westernblot检测人结直肠癌组织中KNL1蛋白和胃癌组织中SETD6和KNL1的表达水平，基于表达水平的差异、靶向基因的定位、质粒构建技术、PCR技术等构建了可特异性抑制KNL1基因表达的慢病毒shRNA载体，并通过观察其基因沉默的效果，构建沉默KNL1基因的人结肠腺癌细胞株，同时观察、评价KNL1对人结肠腺癌细胞增殖和凋亡的影响。
第一部分KNL1、SETD6在胃肠肿瘤中的表达及临床意义
目的：探讨人结直肠癌组织及对应的癌旁正常组织中KNL1的mRNA和蛋白表达与SETD6蛋白表达水平的差异，研究人胃癌组织及对应的癌旁正常组织中SETD6、KNL1蛋白表达水平的差异，并将KNL1蛋白的表达水平与结直肠癌患者的临床病理参数、预后以及与SETD6蛋白表达水平进行相关性分析。
方法：
1采用免疫组织化学的方法检测108例人结直肠癌组织标本中KNL1和SETD6蛋白的表达情况；评价KNL1蛋白在人结直肠癌组织标本中的表达情况与临床病理特征之间的关系；采用统计方法分析人结直肠癌组织标本中KNL1蛋白与结直肠癌患者生存期之间的关系。采用统计方法分析人结直肠癌组织标本中KNL1蛋白与SETD6蛋白表达之间的关系。
2应用RT-qPCR检测人结直肠癌组织标本中KNL1的mRNA表达水平；应用Westernblot检测人结直肠癌组织标本中KNL1蛋白的表达水平；应用Westernblot检测人胃癌组织标本中SETD6、KNL1蛋白的表达水平。
3经过电话回访、门诊随访等不同方式了解108例结直肠癌患者的生存情况。收集结直肠癌患者完整的临床信息，包括患者的肿瘤分化程度、性别、年龄、临床分期、肿瘤部位、肿瘤浸润深度和淋巴结转移等信息资料，并对这些信息资料进行统计和分析。
4免疫组织化学结果的评估由两名资深的病理医师采用双盲方法各自独立进行。结直肠癌细胞的染色强度分为4个等级，其中0表示没有癌细胞染色，1表示弱染色，2表示中度染色，3表示强染色。此外，染色的癌细胞百分比也分成4个等级，其中0表示无，1表示＜10％，2表示10-50％，3表示＞50％。此外，用强度等级评分乘以染色等级百分比评分得到平均的总分。计算分析108个结直肠肿瘤的KNL1和SETD6免疫组化的平均分为4.9和5.4。因此，选择4.9和5.4分作为截止点，以区分KNL1和SETD6的表达状态。其中，得分＞4.9和＞5.4的样品为KNL1和SETD6阳性表达，得分≤4.9和≤5.4的样品为KNL1和SETD6阴性表达。
结果：
1KNL1、SETD6在癌旁正常组织及胃肠肿瘤组织中的表达情况
RT-qPCR结果显示，与对应的癌旁正常组织相比，结直肠癌组织中KNL1的mRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；Westernblot结果显示，与对应的癌旁正常组织相比，结直肠癌组织中KNL1蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，与对应的癌旁正常组织相比，胃癌组织中SETD6和KNL1蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；免疫组织化学结果示，108例结直肠癌患者中75(69.4%)例癌组织中KNL1蛋白表达高于其对应的癌旁正常组织，33(30.6%)例癌组织中KNL1蛋白表达与其对应的癌旁正常组织相比，无明显差异或表达下调；108例结直肠癌患者中70(64.8%)例癌组织中SETD6蛋白表达高于其对应的癌旁正常组织，38(35.2%)例癌组织中SETD6蛋白表达与其对应的癌旁正常组织相比，无明显差异或表达下调；免疫组织化学结果显示，KNL1和SETD6在结直肠癌组织中阳性表达分别为75例和70例，阳性表达率69.4%和64.8%，阳性表达主要定位在细胞核中。
2KNL1与结直肠癌患者各临床病理参数之间的关系
KNL1蛋白的表达水平与结直肠癌患者的性别、年龄、临床分期、肿瘤部位、肿瘤浸润深度和淋巴结转移均无明显相关性(P＞0.05)，但与肿瘤分化程度有显著相关性(P＜0.05)。
3KNL1与结直肠癌患者5年生存率的关系
KNL1阳性表达的患者中位生存时间为35个月，KNL1阴性表达的患者中位生存时间为50个月，两者比较有显著差异，KNL1阳性表达患者的预后劣于KNL1阴性表达的患者(P=0.010)。
4KNL1与SETD6蛋白表达的关系
KNL1蛋白的表达与SETD6蛋白的表达存在显著相关性(P＜0.0001)。
结论：结直肠癌组织中KNL1的mRNA、蛋白和SETD6的蛋白表达上调，结直肠癌组织中的KNL1阳性表达与肿瘤分化程度相关。胃癌组织中SETD6、KNL1的蛋白表达上调。KNL1阳性表达患者的预后劣于KNL1阴性表达的患者。KNL1与SETD6蛋白的表达存在显著相关性。
第二部分KNL1基因沉默结肠腺癌细胞株的构建
目的：通过对靶标KNL1基因短发夹结构RNA(shRNA)以及其慢病毒表达载体的构建，然后转染人结肠腺癌细胞，创建KNL1基因沉默的人结肠腺癌细胞株。
方法：
1运用基因查序的办法获取KNL1基因的靶标序列，然后衔接到GV115慢病毒载体，顺利得到携带KNL1基因的慢病毒shRNA载体。
2装配慢病毒，然后转染293T细胞，获取高滴度的慢病毒浓缩液，对慢病毒浓缩液进行病毒滴度的检测。
3应用RT-qPCR和WesternBlot技术方法检验目标基因的敲低效果，创立KNL1基因沉默的人结肠腺癌细胞株。
结果：
1成功构建的KNL1-shRNA干扰慢病毒载体通过鉴定测序，检测结果与目标基因序列完全相同，证明KNL1基因干扰慢病毒载体被成功的构建。
2应用荧光显微镜进行慢病毒滴度测量并结合稀释倍数得出病毒滴度，计算出慢病毒滴度为：
KNL1-shRNA的感染滴度约为1×108TU/mL。
3慢病毒感染细胞情况
控制慢病毒的感染滴度为1×108TU/mL时，按照1:5稀释实施感染，shKNL1病毒感染效率基本可以到达80%以上。
4shRNA慢病毒对人结肠腺癌细胞KNL1mRNA表达的影响
shKNL1组相对于阴性对照shCtrl组的KNL1mRNA表达水平明显降低(P＜0.05)。
5shRNA慢病毒对人结肠腺癌细胞KNL1蛋白表达的影响
阴性对照细胞shCtrl组和shKNL1组KNL1蛋白表达水平有显著差异，shKNL1组KNL1蛋白表达水平的灰度值有显著降低(P＜0.05)。
结论：运用RNA干扰手段成功地建立了KNL1基因沉默的人结肠腺癌细胞株，为后续实验提供了靶标细胞。
第三部分重组慢病毒GV115/KNL1shRNA对结肠癌细胞RKO和HT-29生物学功能的影响
目的：研究KNL1对人结肠腺癌细胞RKO和HT-29增殖和凋亡的影响，为临床通过调节结直肠癌KNL1蛋白水平抑制肿瘤的增殖提供理论依据。
方法：
1应用MTT、克隆形成检测各组细胞的增殖情况。
2应用Celigo细胞计数法检测各组细胞的生长情况。
3应用流式细胞检测法检测各组细胞的凋亡情况。
结果：
1沉默KNL1基因对细胞增殖的影响
shRNA-KNL1与空白对照组及阴性对照组在72h、96h、120h相比较，OD值均明显减小，差异有统计学意义(shRNA-KNL1组VS阴性对照组：P＜0.01)；(shRNA-KNL1组VS空白对照组：P＜0.01)。
2沉默KNL1基因对细胞生长的影响
shRNA-KNL1与空白对照组及阴性对照组在72h、96h、120h相比较，细胞数均明显减小，差异有统计学意义(shRNA-KNL1组VS阴性对照组：P＜0.01)；(shRNA-KNL1组VS空白对照组：P＜0.01)。
3沉默KNL1基因对细胞凋亡的影响
shRNA-KNL1、阴性对照组细胞凋亡率分别为(14.86±0.31)%、(4.32±0.14)%。shRNA-KNL1组与阴性对照组相比较凋亡率差异有统计学意义(shRNA-KNL1组VS阴性对照组：P＜0.01)。
结论：采用RNA干扰技术(质粒瞬时转染及慢病毒稳定转染)有效沉默KNL1基因后，能够明显抑制人结肠腺癌细胞RKO和HT-29的生长和增殖；并且沉默KNL1基因还可以促进人结肠腺癌细胞RKO的凋亡。
总结：
1人结直肠癌组织中KNL1的mRNA、蛋白和SETD6蛋白表达水平显著高于癌旁正常组织，蛋白主要定位于细胞核表达。胃癌组织中SETD6和KNL1的蛋白表达上调。KNL1蛋白的表达水平与结直肠癌患者的性别、年龄、临床分期、肿瘤部位、肿瘤浸润深度和淋巴结转移均无显著相关性，与肿瘤分化程度存在显著正相关。KNL1阳性表达患者的预后劣于KNL1阴性表达的患者。人结直肠癌组织中KNL1蛋白与SETD6蛋白表达存在显著相关性。提示KNL1可能是人结直肠腺癌不良预后的潜在肿瘤生物标志物。
2成功构建GV115/KNL1shRNA的慢病毒表达载体，成功制备高滴度的重组慢病毒GV115/KNL1shRNA，并能有效感染人结肠腺癌细胞株；重组慢病毒GV115/KNL1shRNA感染人结肠腺癌细胞株后，能显著抑制KNL1的mRNA表达和蛋白表达，成功地建立了KNL1基因沉默的人结肠腺癌细胞株，为下一步实验提供了实验靶细胞。
3重组慢病毒GV115/KNL1shRNA能有效抑制RKO和HT-29细胞的生长、增殖、克隆形成，促进RKO细胞凋亡，体外试验进一步表明KNL1可能是结直肠腺癌一个潜在的治疗靶点。