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鄂伦春马是我国重要濒危物种之一,现存数量极少、不足千匹,构建鄂伦春马的cDNA文库对于鄂伦春马遗传资源的保护以及马基因功能的研究具有重要意义。本研究构建了鄂伦春马耳缘组织cDNA文库,成功从文库中克隆了单核细胞趋化蛋白(MCP-1,macrophage chemotactic protein)基因,即CCL2基因,顺利构建了CCL2基因的原核和真核表达载体,并在体外培养蒙古马成纤维细胞中进行了表达和亚细胞定位研究。本研究取鄂伦春马耳缘组织,提取总RNA,运用SMARTTM技术构建了鄂伦春马耳缘组织cDNA文库。所构建的cDNA文库未扩增文库滴度为3.09×106pfu/ml,扩增后文库的滴度为1.4×1010 pfu/ml。从扩增文库中随机挑取96个克隆进行PCR鉴定,结果表明重组率为93.75%,插入片段平均大小为1.1 kb。本研究的实施不仅对于马基因结构与功能研究具有重要意义,更重要的是对于鄂伦春马基因资源的保存具有重要意义。本研究取蒙古马的耳缘组织,通过组织块贴壁培养法,成功构建了蒙古马的成纤维细胞系,并对所建细胞系进行了各项生物学特性检测。结果表明,细胞系的各项指标均达到美国典型培养物中心(American type Culture Collection,ATCC)细胞系鉴定标准,为研究外源基因在成纤维细胞中的表达与调控提供了优质的靶细胞。本研究成功构建了CCL2基因的原核表达载体pGEX-4T-1-CCL2,并设置IPTG的终浓度梯度进行诱导表达,SDS-PAGE检测pGEX-4T-1-CCL2融合蛋白的表达结果显示,与对照组相比,实验组在36kD左右的位置出现CCL2融合蛋白的表达带,但各实验组之间的差异不明显,表明CCL2基因在BL21菌中表达成功,但诱导条件需要进一步优化。本研究利用构建好的鄂伦春马耳缘组织cDNA文库为模板,成功克隆了CCL2基因,将CCL2基因完整的编码区定向插入真核表达载体pEGFP-N3,pEYFP-N1和pDsRed1-N1的多克隆位点EcoR I和Sal I之间,成功构建带有荧光蛋白报告基因的真核重组表达载体pEGFP-N3-CCL2、pEYFP-N1-CCL2和pDsRed1-N1-CCL2。采用脂质体介导法,将pEGFP-N3-CCL2、pEYFP-N1-CCL2和pDsRed1-N1-CCL2导入蒙古马体外培养成纤维细胞中。对CCL2基因的表达、亚细胞定位、阳性细胞生长与增殖状况以及细胞活力进行了研究。结果发现,在转染后24、48和72h,各个重组融合蛋白的转染率在11.1%～36.3%之间。重组融合蛋白在蒙古马成纤维细胞的细胞核与细胞质均有分布,其中转染后24h荧光在细胞核和细胞质中分布均匀,而到转染后72h细胞核的荧光强度明显高于细胞质,将转染的细胞进行RT-PCR鉴定,证明了CCL2融合蛋白基因成功转染至蒙古马成纤维细胞中并获得了表达。