调控混合菌群和营养结构强化餐厨垃圾产乳酸效能及机制研究

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乳酸是一种天然有机酸,广泛应用于食品、制药、化工等领域。传统的乳酸发酵方法以昂贵碳源为原料,依赖严苛的灭菌及纯菌操作等要求。因此,利用混合菌群,以有机废弃物为原料发酵制备乳酸,对发展生物炼化资源化具有重要意义。餐厨垃圾和剩余污泥是两种典型的是有机废弃物,其产量大、不稳定、易腐败,处理不当会对生态环境和居民健康构成严重威胁。其中餐厨垃圾富含碳水化合物,微生物群落单一,乳酸发酵效率低,而剩余污泥富含发酵菌群和蛋白质,但碳水化合物含量少,不适合作为乳酸发酵的基质。然而,利用剩余污泥调控餐厨垃圾厌氧发酵,不仅可以实现多种有机废弃物的资源化,而且还提供了调控混合菌群产乳酸的新思路。但较多研究关注两者联合发酵制备挥发性脂肪酸(VFA)、氢气、甲烷等,针对乳酸发酵及其机理的研究尚不充分。因此,本论文从餐厨垃圾和剩余污泥资源化角度出发,研究了短期分批发酵(Batch)、长期重复分批发酵(Repeated batch)和半连续发酵(Semi-continuous)模式,揭示了剩余污泥调控混合菌群及氨氮补加平衡营养结构强化餐厨垃圾产乳酸的效能及机制,主要研究成果如下:(1)在短期分批发酵模式下,探究了剩余污泥调控餐厨垃圾发酵产乳酸的最佳参数及影响机制。结果表明,不同温度下产乳酸的最优发酵组合条件是:温度20°C与pH 11、温度35°C与pH 9和温度50°C与pH 7,对应的乳酸产率分别为0.45 g COD/g TCOD、0.67 g COD/g TCOD和0.55 g COD/g TCOD。响应面分析证明温度和pH对总乳酸和L-乳酸产量有交互影响,而温度对D-乳酸产量影响较弱。机理研究表明:1)溶出及水解效率随着温度及pH提高而增加;2)碳水化合物利用率在中温条件下最高,在室温、高温或强碱条件下较低;3)乳酸转化为VFA的代谢效率在强碱条件下较低,有利于乳酸的稳定积累;4)在上述三种最优组合条件下,产乳酸相关的n-LDH酶相对活性显著提高;5)基于高通量测序技术,发现乳酸菌群在温度20°C与pH 11(Enterococcus)、温度35°C与pH 9(Clostridium、Dysgonomonas、Streptococcus和Alkaliphilus)和温度50°C与pH 7(Clostridium和Caloramator)条件下得以选择性筛选和富集,从而提高了乳酸产量。(2)在此基础上,进一步探究了剩余污泥调控餐厨垃圾发酵在长期运行模式下的产乳酸效能。半连续发酵结果显示,稳定阶段乳酸产量低于1 g COD/L,大量乳酸转化为以乙酸、丙酸和正丁酸为主的VFA(17.74±1.25 mg/L),不利于乳酸的积累;溶解性碳水化合物浓度低至0.58±0.20 g COD/L,限制了乳酸的产生。重复分批发酵(4天/批次,8批)结果表明:在单个发酵批次内,乳酸在2-3日内快速产生(20.79-35.50 g COD/L),但批次间产率波动大;单个批次的3-4日乳酸浓度迅速下降并产生以乙酸和丙酸为主的VFA(4.50-17.56 g COD/L),L-乳酸光学活性较低(35.18-64.43%)。高通量测序发现,在长期发酵模式中,发酵系统补充剩余污泥引入了消耗乳酸的发酵微生物,引起了乳酸的消耗和扰动。因此,有必要研究剩余污泥和餐厨垃圾联合发酵过程中促进乳酸生成的关键因素,稳定长期发酵过程中的功能微生物群,稳定产生高质量的乳酸。(3)为进一步解决上述问题,在重复分批发酵模式下,利用剩余污泥调控菌群,对比了不同底物对餐厨垃圾产乳酸的影响,即1)单一餐厨垃圾发酵,作为无剩余污泥影响的对照组(Ctrl);2)餐厨垃圾中补加灭活后的剩余污泥,排除剩余污泥中混合菌群的影响,代表剩余污泥补加的有机氮源(Organic nitrogen,Org-N);3)餐厨垃圾中补加氨氮,模拟剩余污泥的关键作用因子(Ammonium nitrogen,Am-N)。结果表明:氨氮投加量为300 mg/L时,乳酸产量从11.63±2.16 g COD/L(Ctrl)提高到24.49±3.56g COD/L(Am-N)且不被消耗,同时L-乳酸光学活性(76.79±18.39%)是Ctrl组的5倍;添加有机氮源实验组(Org-N)的乳酸产量也相应提高至20.94±3.21 g COD/L,但无法稳定积累,易转化为以乙酸为主的VFA(9.71±3.47g COD/L),这与蛋白质为主的底物易促进VFA产生相关。发酵代谢研究发现,补加氨氮(Am-N)和灭活污泥(Org-N)均可以促进餐厨垃圾的溶出、水解、糖酵解和产酸过程,但氨氮的加入显著降低了i-LDH的酶活性,减少了乳酸的消耗,因此Am-N组的乳酸产率相对稳定。高通量测序发现,添加氮源可显著提高产乳酸微生物总相对丰度(Ctrl:19.4%、Am-N:86.6%和Org-N:80.0%),增强碳水化合物代谢(Carbohydrate Metabolisms)、膜转运(Membrane Transport)代谢通路的相对丰度,有效提升体系产乳酸能力;尤其是氨氮的加入富集了Streptococcus、Lactococcus、Enterococcus和Corynebacterium等L-乳酸菌,提高了L-乳酸脱氢酶编码基因(ldhL)的相对丰度,降低了D-乳酸脱氢酶编码基因(ldhD)的相对丰度,增加体系乳酸产量的同时提高了L-乳酸的光学活性。同时,补加氨氮可以维持发酵系统的还原环境,Am-N组ORP稳定在-428±41 mV-333±30 mV,Ctrl组则在-427±21 mV-200±28 mV较大范围内变化。氨氮的加入可提高胞内NADH浓度和NAD+/NADH比率,更利于丙酮酸还原生成乳酸。15N同位素示踪技术表明47%的氨氮用于生物同化。(4)基于上述研究,针对半连续发酵模式下联合发酵也不利于乳酸积累的问题,提出利用氨氮实现营养平衡以强化餐厨垃圾产乳酸的方法。进一步考察了三种最佳乳酸发酵参数(温度20°C与pH 11、温度35°C与pH 9和温度50°C与pH 7)下,氨氮投加模式(直接投加与滞后补加)对长期发酵产乳酸的影响,并揭示了游离氨(NH3-N,FAN)和铵离子(NH4+-N)两种形态对发酵过程的影响。结果证明,直接投加氨氮时乳酸浓度分别为23.92±1.41 g COD/L(温度35°C与pH 9)和14.85±2.74 g COD/L(温度50°C与pH 7),显著高于不投加组和室温碱性发酵(温度20°C与pH 11)。缺氮系统滞后补加氨氮亦能恢复乳酸产量。机理研究表明中温与pH 9条件下适宜的FAN(79.64-94.51 mg/L)和NH4+-N(70.23-83.34 mg/L)浓度可促进底物的溶出、水解、糖酵解和产酸过程,高温与pH 7时较高浓度的NH4+-N也可促进水解、糖酵解和产酸过程,而室温与pH 11时高浓度的FAN抑制了乳酸代谢过程。高通量测序结果表明,在中温条件下两种氨氮投加模式均可以富集Bavariicoccus、Bifidobacterium、Enterococcus和Corynebacterium等乳酸菌,同时提高与碳水化合物转运和乳酸产生相关的代谢通路相对丰度,从而提升体系的产乳酸效能。
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