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【目的】
阿尔茨海默病是一种慢性、进行性的神经性疾病。我们前期研究发现，通过侧脑室穿刺插管给予丙酮醛干预大鼠后，发现大鼠的学习记忆能力会有一定程度受损，以及显示其记忆保持能力受损。因此本次实验通过体外实验探讨丙酮醛对神经元凋亡的影响，以及检测丙酮醛干预SHSY-5Y细胞前后miRNA表达差异，通过荧光定量PCR技术验证具有差异表达的miRNAs，预测显著差异表达miRNAs的靶基因、基因聚类项目以及相关的生物学通路，探讨丙酮醛在阿尔茨海默病的发病机制的作用。
【方法】
1.通过在SHSY-5Y细胞上，设置丙酮醛浓度和时间梯度，挑选最适合的药物浓度。
2.Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态变化，流式仪检测MG和乙二醛酶抑制剂诱导的细胞凋亡情况。
3.丙酮醛干预后提取细胞蛋白检测相关蛋白AGES，RAGE，JNK，Bax，Bcl-2，Capase-3表达情况以及血清中活性氧ROS表达变化。
4.提取丙酮醛干预后细胞的RNA，进行miRNA表达谱分析、筛选差异性表达miRNAs:高通量测序；
5.通过生物信息分析，预测靶基因、预测富集生物学通路：利用miRanda对差异表达miRNAs的靶基因进行预测；应用GO基因聚类分析差异表达的miRNAs的靶基因。使用KEGG数据库预测可能富集的生物学信号通路；
6.实时荧光定量PCR验证:选取miRNA高通量检测具有显著差异表达的miRNAs，采用实时荧光定量PCR技术，验证丙酮醛干预后SH-SH5Y细胞中miRNA表达。
7.双荧光素酶报告基因检测miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p与S100B的调控关系。
8.蛋白免疫印迹检测SH-SY5Y细胞转染miR-6827-3p对S100B表达的影
【结果】
1.丙酮醛干预SH-SH5Y细胞，发现呈浓度依赖性抑制细胞活性。
2.丙酮醛和乙二醛酶抑制剂诱导的细胞凋亡增加。
3.丙酮醛干预SH-SH5Y细胞后发现，蛋白免疫印迹发现AGEs、RAGE表达增加，活性氧ROS增加，JNK磷酸化增高，凋亡蛋白capase-3,bax/bcl-2表达增加。
4.丙酮醛干预SH-SH5Y细胞差异表达的miRNAs：发现有27个显著差异表达的miRNAs；
5.通过应用生物信息学分析，具有差异表达的miRNAs：通过miRanda预测软件，得到差异表达miRNAs的靶基因；利用基因聚类，对靶基因进行了分析，得到具有统计学意义的基因聚类项目；应用KEGG数据库，对靶基因进行分析，得到具有显著统计学意义、可能富集的生物学信号通路；
6.筛选miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p进行实时荧光定量PCR验证，结果显示显著下调，与测序结果一致(P<0.05)；
7.双荧光素酶报告基因表明miR-340-3p、miR-6827-3p能够与S100B3’UTR结合(P<0.05)。
8.蛋白免疫检测发现转染miR-6827-3p会影响S100B蛋白表达。
【结论】
1.丙酮醛干预组抑制SH-SY5Y细胞活性，诱导细胞凋亡。
2.丙酮醛在细胞中可能通过晚期糖基化蛋白-晚期糖基化蛋白受体轴，影响下游的通路。
3.通过高通量测序检测得到了丙酮醛干预组可能具有差异表达的27个miRNAs,其中有19个miRNA下调，8个miRNA上调。
4.生物信息学分析得到了差异表达的miRNAs所指向的靶基因、基因聚类、以及生物学富集信号通路，这些靶基因、基因聚类和生物学信号通路被认为与阿尔茨海默病发生发展过程有关。
5.验证了具有差异表达的miRNA：miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p。
6.双荧光素酶报告基因表明miR-340-3p、miR-6827-3p抑制基因型S100B-rs9722-C的表达，不能抑制基因型S100B-rs9722-T的表达。
7.miR-6827-3p转染SH-SY5Y细胞，抑制基因S100B蛋白的表达。
阿尔茨海默病是一种慢性、进行性的神经性疾病。我们前期研究发现，通过侧脑室穿刺插管给予丙酮醛干预大鼠后，发现大鼠的学习记忆能力会有一定程度受损，以及显示其记忆保持能力受损。因此本次实验通过体外实验探讨丙酮醛对神经元凋亡的影响，以及检测丙酮醛干预SHSY-5Y细胞前后miRNA表达差异，通过荧光定量PCR技术验证具有差异表达的miRNAs，预测显著差异表达miRNAs的靶基因、基因聚类项目以及相关的生物学通路，探讨丙酮醛在阿尔茨海默病的发病机制的作用。
【方法】
1.通过在SHSY-5Y细胞上，设置丙酮醛浓度和时间梯度，挑选最适合的药物浓度。
2.Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态变化，流式仪检测MG和乙二醛酶抑制剂诱导的细胞凋亡情况。
3.丙酮醛干预后提取细胞蛋白检测相关蛋白AGES，RAGE，JNK，Bax，Bcl-2，Capase-3表达情况以及血清中活性氧ROS表达变化。
4.提取丙酮醛干预后细胞的RNA，进行miRNA表达谱分析、筛选差异性表达miRNAs:高通量测序；
5.通过生物信息分析，预测靶基因、预测富集生物学通路：利用miRanda对差异表达miRNAs的靶基因进行预测；应用GO基因聚类分析差异表达的miRNAs的靶基因。使用KEGG数据库预测可能富集的生物学信号通路；
6.实时荧光定量PCR验证:选取miRNA高通量检测具有显著差异表达的miRNAs，采用实时荧光定量PCR技术，验证丙酮醛干预后SH-SH5Y细胞中miRNA表达。
7.双荧光素酶报告基因检测miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p与S100B的调控关系。
8.蛋白免疫印迹检测SH-SY5Y细胞转染miR-6827-3p对S100B表达的影
【结果】
1.丙酮醛干预SH-SH5Y细胞，发现呈浓度依赖性抑制细胞活性。
2.丙酮醛和乙二醛酶抑制剂诱导的细胞凋亡增加。
3.丙酮醛干预SH-SH5Y细胞后发现，蛋白免疫印迹发现AGEs、RAGE表达增加，活性氧ROS增加，JNK磷酸化增高，凋亡蛋白capase-3,bax/bcl-2表达增加。
4.丙酮醛干预SH-SH5Y细胞差异表达的miRNAs：发现有27个显著差异表达的miRNAs；
5.通过应用生物信息学分析，具有差异表达的miRNAs：通过miRanda预测软件，得到差异表达miRNAs的靶基因；利用基因聚类，对靶基因进行了分析，得到具有统计学意义的基因聚类项目；应用KEGG数据库，对靶基因进行分析，得到具有显著统计学意义、可能富集的生物学信号通路；
6.筛选miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p进行实时荧光定量PCR验证，结果显示显著下调，与测序结果一致(P<0.05)；
7.双荧光素酶报告基因表明miR-340-3p、miR-6827-3p能够与S100B3’UTR结合(P<0.05)。
8.蛋白免疫检测发现转染miR-6827-3p会影响S100B蛋白表达。
【结论】
1.丙酮醛干预组抑制SH-SY5Y细胞活性，诱导细胞凋亡。
2.丙酮醛在细胞中可能通过晚期糖基化蛋白-晚期糖基化蛋白受体轴，影响下游的通路。
3.通过高通量测序检测得到了丙酮醛干预组可能具有差异表达的27个miRNAs,其中有19个miRNA下调，8个miRNA上调。
4.生物信息学分析得到了差异表达的miRNAs所指向的靶基因、基因聚类、以及生物学富集信号通路，这些靶基因、基因聚类和生物学信号通路被认为与阿尔茨海默病发生发展过程有关。
5.验证了具有差异表达的miRNA：miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p。
6.双荧光素酶报告基因表明miR-340-3p、miR-6827-3p抑制基因型S100B-rs9722-C的表达，不能抑制基因型S100B-rs9722-T的表达。
7.miR-6827-3p转染SH-SY5Y细胞，抑制基因S100B蛋白的表达。