基于单细胞测序的乙肝疫苗无免疫应答者外周血单个核细胞的转录特征研究

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背景:乙肝疫苗产生后,使乙型肝炎的预防工作取得了突破性的进展。世界卫生组织提出“到2030年消除病毒性肝炎”的目标,但仍有部分儿童由于乙肝疫苗无免疫应答而发生乙型肝炎病毒的突破性感染。因而探索调控乙肝疫苗免疫应答强度的关键靶点对研发靶向疫苗、消除乙型肝炎病毒感染至关重要。然而,乙肝疫苗在体内引起的免疫反应是复杂的,不同免疫细胞的相互作用调控机体对疫苗的反应强度及疫苗诱导的炎性反应的平衡性。目前,有关乙肝疫苗无免疫应答者转录特征的研究多采用传统测序技术,得到的是群体信息的平均质,很难获得各免疫细胞的转录特征及关键分子,乙肝疫苗无免疫应答的分子机制仍未完全阐明。单细胞RNA测序技术弥补了传统测序技术的不足,使研究者可以获得各个细胞的转录特征并揭示决定表型的关键细胞及分子。目的:本文旨在通过单细胞RNA测序技术分析乙肝疫苗高免疫应答和无免疫应答者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的各免疫细胞亚型的转录特征差异,以期获得乙肝疫苗免疫后无免疫应答者和高免疫应答者外周血中各免疫细胞的转录特征,为全面了解乙肝疫苗高免疫应答和无免疫应答个体间的转录特征差异及调控乙肝疫苗免疫应答强度的关键细胞及靶点提供数据基础,为进一步揭示乙肝疫苗高免疫应答个体和乙肝疫苗无免疫应答个体的免疫细胞在对抗肝炎病毒的功能上存在的差异提供线索。方法:招募有乙肝疫苗接种史但乙型肝炎病毒表面抗体阴性的志愿者,按0、1、6月程序接种3次乙肝疫苗后,筛选性别、年龄、民族匹配的3例乙肝疫苗高免疫应答(high immune response,HR)和3例乙肝疫苗无免疫应答(no immune response,NR)志愿者,采集外周血分离出单个核细胞后进行单细胞RNA测序。然后,根据各细胞转录本的特征对细胞进行降维、聚类和细胞群命名后,通过对预定义基因集的表达富集评分、基因表达差异分析和差异基因功能富集分析等方法分析各细胞群的转录本在各组中的表达水平和功能的差异。最后,用q RT-PCR验证关键基因在组间的表达差异。结果:(1)鉴定出了18种细胞亚群,各亚群的细胞数量在HR组和NR组中所占比例无统计学差异。(2)与HR组比较,在乙肝疫苗NR组的抗原提呈细胞各亚群中,HLA-II类分子的基因集的表达富集分数显著降低;除p DC外,HLA-I类分子的基因集富集分数也显著降低;同时,低表达的差异基因显著富集于抗原处理与呈递信号通路,其中具有代表性的基因为HLA-DRB5和HLA-B。(3)与HR组比较,在乙肝疫苗NR组的幼稚B细胞中,MAPK基因集富集分数显著降低;低表达基因显著富集于B细胞受体下游通路钙离子反应,一些关键分子BLNK、BLK、SCIMP、IL4R、NFKBIA、JUN的表达水平显著降低。(4)与HR组比较,在乙肝疫苗NR组中,基因表达差异最显著的三类T细胞亚群,即CD8+效应记忆性T细胞、CD8+效应性T细胞和CD4+效应性T细胞的细胞活性基因集富集分数也显著降低;低表达的差异基因也显著富集于细胞活性相关信号通路;另外,各T细胞亚群中共同低表达的差异基因显著富集于氧化磷酸化和钙离子反应信号通路,连接这两条通路的关键基因为JUN;(5)与HR组比较,在NR组的一类以高表达CD3和KLRG1,低表达CD16为特征的NKT细胞(CD3high CD16low KLRG1high NKT)中,一些具有代表性的细胞毒性基因,包括GNLY、NKG7、GZMB、GZMM、KLRC1、KLRD1、PRF1、CST7和CTSW的表达水平升高;细胞毒性基因集富集分数显著升高;该类细胞中高表达的差异基因显著富集于细胞毒性相关通路。(6)与HR组比较,HLA-B、TXNIP、JUN在NR组的大多数细胞亚群中显著低表达。结论:(1)NR组中各类抗原提呈细胞中抗原提呈基因集、Naive B细胞中MAPK通路基因集和三类效应性T细胞(CD8+Tem、CD8+Teff和CD4+Teff)中细胞活化基因集的表达水平降低,以及CD3high CD16low KLRG1high NKT中细胞毒性基因集的表达水平升高与乙肝疫苗无免疫应答相关;(2)HLA-B、HLA-DRB可能是负责乙肝疫苗抗原提呈的关键基因;(3)BLNK、BLK、IL4R、SCIMP、NFKBIA、JUN可能是影响Naive B细胞对乙肝疫苗免疫应答强度的关键基因;(4)HLA-B、TXNIP、JUN是调节各免疫细胞亚群对乙肝疫苗反应的关键分子。
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