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DUF231家族是植物中特有的一类含有未知功能结构域（domain of unknown function,DUF）的蛋白,参与调控植物生长发育及逆境胁迫应答等生理代谢过程。许多研究表明,植物DUF231家族蛋白主要行使木聚糖O-乙酰转移酶的功能,但其参与的具体分子机制尚不清楚。棉纤维是由胚珠表皮细胞通过极性伸长生长分化形成的单细胞毛状物,棉纤维细胞壁的主要成分为纤维素、半纤维素（木聚糖）和木质素。木聚糖通过氢键与纤维素微纤丝相互连接,通过共价键与木质素相连接,各组分的充分连接形成了完整的细胞壁结构并维持了细胞壁硬度。木聚糖的乙酰化修饰直接影响木聚糖与纤维素微纤丝之间的连接状态,从而影响细胞壁发育。为了探究陆地棉（Gossypium hirsutum）DUF231家族蛋白是否通过行使木聚糖O-乙酰转移酶的功能来调控棉花纤维细胞壁发育,本文系统筛查了陆地棉基因组中DUF231家族基因,鉴定了一个与棉纤维次生细胞壁发育相关的GhDUF231L1基因,并对该基因的功能及分子调控机制进行了深入研究。此外,本文也通过定量比较磷酸化蛋白质组学分析技术,鉴定了一个影响棉纤维伸长发育的蔗糖合酶蛋白GhSUS2。本文的主要研究结果如下:1、棉花纤维次生细胞壁发育相关的GhDUF231家族基因的鉴定分析本文从陆地棉（Gosrsutum）基因组中共鉴定得到了 100个GhDUF231家族基因。利用Hmmscan程序和pfam工具对鉴定到的GhDUF231蛋白的保守基序进行分析,发现只有1个GhDUF231蛋白不含有GDS和DxxH保守基序,其余蛋白均含有其中的一个或两个基序,说明该家族蛋白在结构上具有一定的保守性及相似性。染色体定位分析发现,91个GhDUF231家族基因在基因组不同染色体上不均匀分布,另外9个GhDUF231基因位于scaffolds上,片段重复是主要的基因复制事件,是GhDUF231家族基因扩增的主要方式。系统发育分析表明,GhDUF231家族蛋白在进化树中共被分为11个分支。基于公共转录组数据库,鉴定了 45个在棉花纤维次生细胞壁发育时期表达较高的GhDUF231基因。其中,GhDUF231L1主要在15-21 DPA棉纤维中高表达。2、GhDUF231L1参与调控棉纤维次生细胞壁的发育GhDUF231L1蛋白定位于高尔基体中,能回补拟南芥同源基因tbl3突变体中木聚糖乙酰化水平降低的表型,暗示GhDUF231L1可能行使木聚糖乙酰转移酶的功能。构建了 GhDUUF231L1过量表达（OE）和 RNA 干扰（RNA interference,RNAi）载体,获得了GhDUF231L1 OE 及 RNAi转基因棉花植株。＜与野生型相比,GhDUF231L1 OE与RNAi转基因棉花植株成熟纤维长度均明显变短。对转基因棉花纤维次生细胞壁表型进行观察发现,过量表达GhDUF231L1基因导致棉纤维次生细胞壁明显增厚,结晶纤维素（次生壁主要组分）含量明显升高;相反,抑制GhDUF231L1表达,棉纤维次生细胞壁变薄,结晶纤维素含量明显降低。而且,过量或抑制GhDUF231L1的表达导致成熟棉纤维断裂比强度及马克隆值均发生显著变化,以上结果说明GhDUF231L1参与调控棉纤维次生细胞壁发育。3、GhDUF231L1作为木聚糖O-乙酰转移酶在棉纤维发育过程中发挥功能细胞壁中性单糖含量检测发现,与野生型相比,GhDUF231L1 OE转基因棉花纤维细胞壁中Xyl和Glu含量明显升高,而GhDUF231L1 RNAi中正好相反。其他细胞壁中性单糖含量并未发生明显变化。Xyl是木聚糖的主要成分,而Glu是结晶纤维素的主要成分。免疫荧光分析表明,与野生型相比,GhDUF231L1 OE转基因棉纤维中LM10和S4B荧光强度更强,即木聚糖及结晶纤维素含量更高,而RNAi转基因棉纤维中刚好相反。而且,与野生型相比,GhDUF231L1 OE转基因棉纤维细胞壁中木聚糖组分的乙酰化修饰水平明显升高,而RNAi棉纤维细胞壁中木聚糖组分的乙酰化修饰水平明显降低,说明GhDUF231L1可能行使木聚糖乙酰转移酶功能。通过核磁共振（1H-NMR）技术进一步证实了 GhDUF231L1的主要作用底物为木聚糖,且主要进行2-O-Ac-xylan和3-O-Ac-xylan单乙酰化修饰。以上结果证明了 GhDUF231Ll主要作为木聚糖O-乙酰转移酶在棉纤维次生细胞壁发育中发挥功能。4、GhMYBL1和GhKNL1能够直接与GhDUF231L1启动子结合为了进一步研究GhDUF231L1参与调控棉纤维次生细胞壁发育的新的分子机制,以GhDUF231L1启动子为诱饵,对野生型植株18 DPA纤维的cDNA文库进行了酵母单杂交筛选鉴定。在筛选得到的候选蛋白中发现有两个参与调控棉纤维次生细胞壁发育的转录因子GhMYBL1和GhKNL1,酵母单杂交回转验证实验也证实了 GhMYBL1和GhKNL1能直接结合在GhDUF231L1的启动子上。随后的ChIP-qPCR实验及EMSA实验也分别从体内及体外再次证实了 GhMYBL1和GhKNL1能够直接结合在GhDUF231L1的启动子上。5、GhMYBL1和GhKNL1拮抗调控GhDUF231L1表达从而维持棉纤维中木聚糖乙酰化修饰水平为了进一步验证GhMYBL1和GhKNL1与GhDUF231L1的遗传学关系,首先获得了GhMYBL1 RNAi转基因棉花植株,表型分析发现,与野生型相比,GhMYBL1 RNAi转基因棉花纤维次生细胞壁厚度明显变薄,结晶纤维素含量明显降低,GhMYBL1正调控棉纤维次生细胞壁发育。与野生型相比,GhMYBL1 RNAi转基因棉花纤维细胞壁中Xyl和Glu单糖含量显著降低,棉花纤维细胞壁中木聚糖的乙酰化修饰水平明显降低,以上结果进一步从遗传学上证实了GhMYBL1通过直接正调控GhDUF231L1的表达提高棉纤维中木聚糖的乙酰化修饰,从而促进棉纤维次生细胞壁发育。同样地对获得的GhKNL1 RNAi转基因棉花植株的表型进行分析发现,与野生型相比,GhKNL1 RNAi转基因棉花植株成熟棉纤维长度明显变长,棉纤维细胞次生壁厚度增加,结晶纤维素含量升高,GhKNL1负调控棉纤维次生细胞壁发育。与野生型相比,GhKNL1 RNAi转基因棉纤维细胞壁中Xyl和Glu含量升高,细胞壁中木聚糖组分的乙酰化水平也明显升高,以上结果证实了 GhKNL1通过直接调控GhDUF231L1的表达抑制棉纤维中木聚糖乙酰化修饰,从而负调节棉纤维次生细胞壁发育。综合以上结果可知,GhMYBL1作为正调控因子,GhKNL1作为负调控因子,两者拮抗调控GhDUUF231L1的表达,维持细胞壁中木聚糖乙酰化水平的稳定,调节棉纤维次生细胞壁的发育。6、定量比较磷酸化蛋白质组学分析揭示ABA信号通过GhCPK84和GhCPK93介导的GhSUS2磷酸化而抑制棉纤维伸长发育形态分析表明,遗传背景几乎一致的棉花变异材料J7-1成熟棉纤维长度较J14-1更长。利用TMT标记的蛋白质定量分析技术,在这两种棉花变异材料10 DPA纤维中共鉴定出32个差异表达蛋白（DEPs）。COG/KOG分析表明,DEPs主要富集于“翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣蛋白”细胞过程和信号转导类途径。定量比较磷酸化蛋白质组学分析表明,在J14-1和J7-1之间共检测到89个磷酸化的DEPs。GO分析表明,磷酸化的DEPs主要具有蔗糖合酶活性、转移酶活性、葡萄糖基转移酶活性和UDP-糖基转移酶活性等。在J14-1中,蔗糖代谢途径的关键酶GhSUS2蛋白磷酸化水平显著高于J7-1,说明GhSUS2磷酸化水平改变对于棉纤维发育可能具有重要作用。通过病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）获得了 GhSUS2基因沉默棉花植株（TRV:GhSUUS2）。与对照相比,TRV:GhSUS2植株成熟纤维长度变短,说明GhSUS2正调控棉纤维伸长发育。GhSUS2定位于细胞膜,主要催化蔗糖分解为UDPG与果糖,为纤维伸长所需的纤维素合成提供底物。在纤维发育过程中,GhSUS2在Ser11被Ca2+依赖蛋白激酶GhCPK84和GhCPK93磷酸化,磷酸化的GhSUS2定位于细胞质中,增强了其蔗糖分解活性,产生更多的细胞质定位的UDPG,增加的细胞质UDPG和果糖重新合成蔗糖,而不再为纤维素合成提供底物,从而减缓了棉纤维伸长发育。此外,外源ABA能显著提高GhCPK84和GhCPK93表达水平,促进GhSUS2的磷酸化,增强GhSUS2的蔗糖分解活性,产生更多的细胞质定位的UDPG,从而严重影响棉纤维伸长过程,导致成熟纤维更短。与J7-1相比,J14-1中GhSUS2的磷酸化水平明显升高,成熟棉纤维长度变短,进一步说明磷酸化的GhSUS2负调控棉纤维伸长。综上所述,通过定量比较磷酸化蛋白质组学分析技术,揭示了 ABA信号通过GhCPK84和GhCPK93介导的GhSUS2磷酸化而抑制棉纤维伸长发育的分子机制。棉纤维伸长决定最终成熟纤维长度,次生细胞壁增厚决定最终成熟纤维的强度和细度,而这两个指标是衡量棉纤维品质的关键。本文通过研究GhDUF231L1和GhSUS2分别在棉纤维发育的不同时期表达,通过分别影响棉纤维细胞壁组分的合成或修饰从而影响棉纤维细胞壁的发育,进而调控棉纤维品质的研究,为利用基因工程手段改良棉纤维品质提供了一定的科学依据。