研究背景和目的癌症的发病率和死亡率在我国日益凸显,癌症位居我国死因之首。据最新统计,2015年肺癌仍然是我国发病率及致死率最高的恶性肿瘤。近年来,肺癌分子靶向治疗相关的大型临床研究结果陆续公布并成功运用于临床,其中表皮生长因子-酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)已经成为EGFR(epidermal growth factor receptor, EGFR)突变型晚期NSCLC患者的一线、二线治疗,显著延长患者中位无进展生存期及总生存时间,但由于EGFR-TKIs获得性耐药的出现,接受EGFR-TKIs治疗的患者其中位无进展时间也仅为8-10个月,因此,探索EGFR-TKIs获得性耐药新机制,积极寻求逆转耐药的新方法将具重要的临床意义。基础及临床研究显示,EGFR突变型的NSCLC细胞,其对EGFR-TKIs获得性耐药的主要机制为MET基因的扩增及EGFR基因的二次突变(第20外显子的T790M突变),二者所占比重分别约为50%和20%,其中约有10%重叠,故约60%的EGFR-TKIs获得性耐药由这两种机制介导[4-7]。但仍有约40%的耐药机制尚未明确,研究显示其可能与肝细胞生长因子(HGF)过表达、蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)表达下调或缺失、EGFR下游信号通路分子异常活化、EGFR以外的旁路酪氨酸激酶受体(如IGF-1R)信号传导通路的异常激活、EML4-ALK融合基因及上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)有关。上皮间质转化(EMT)是上皮细胞失去上皮表型,获得间质细胞相关特性的一种生物学现象,在细胞形态学上表现为细胞变得梭长、细胞间连接变得疏松,分子水平上表现为其E-钙黏蛋白、角蛋白等上皮标记蛋白表达下调,波形蛋白、N-钙黏蛋白、纤维连接素等间质标记基因表达升高。EMT不仅与肿瘤细胞的原位侵袭、远处转移及药物获得性耐药密切相关,而且还与NSCLC患者的预后及对EGFR-TKIs敏感性有关,国外及本课题组前期研究业已证实,无论是EGFR野生型NSCLC细胞H460还是突变型NSCLC细胞PC-9,它们在EGFR-TKIs诱导获得性耐药过程中均发生了EMT；同时我们首次通过向耐药细胞株H460/ER(H460经厄洛替尼诱导耐药发生EMT)及PC-9/AB(PC-9经吉非替尼诱导耐药发生EMT)转染CDH1基因逆转其EMT后,发现它们对厄洛替尼／吉非替尼的药物敏感性恢复,从正反两方面证实EMT在NSCLC细胞EGFR-TKIs获得性耐药过程中起重要作用。但EMT介导NSCLC细胞EGFR-KTIs获得性耐药的具体机理目前仍不明确。既往研究显示,无论是正常细胞还是肿瘤细胞,其在发生EMT过程中,具有干细胞特性的细胞比例增加。Mani SA等诱导永生化人乳腺上皮细胞(HLMEs)发生EMT后发现具有干细胞特性的细胞生成比例增加了,进一步从HLMEs及人乳腺癌细胞分离出这些具有干细胞特性的细胞(肿瘤干细胞,cancer stem cell,CSC)并检测其EMT,发现这些细胞相应地发生了EMT改变。Polyak K等同样指出,肿瘤细胞在侵袭、演进发生EMT过程中CSC含量增加。Pirozzi,G等[22]用TGF-β1诱导NSCLC细胞发生EMT后,发现这些细胞不仅出现了间质表型,表达干细胞标记的细胞比例也随之增加。这些均说明EMT与CSC相关。CSC不仅可以促进肿瘤生长与转移,还与肿瘤的复发以及包括EGFR-TKIs治疗在内的治疗抵抗相关[23-26]。Hashida S等[24]用阿法替尼诱导得到获得性耐药细胞株HCC827-ACR,诱导耐药后发现这些细胞株不仅展现出EMT特点,还高表达干细胞相关分子如ALDH1A1。Ghosh G等㈣用厄洛替尼诱导得到获得性耐药细胞株H1650-ER1,诱导耐药后发现这些具有干细胞特性的细胞增加了。因此我们提出假设：EMT介导的NSCLC EGFR-TKIs获得性耐药可能与CSC增加有关。目前国内外尚未见相关报道。CSC是指肿瘤组织中那些具有自我更新、分化能力并具有宿主体内成瘤潜能的一小类亚群细胞。这类细胞具有以下特性： (1)肿瘤组织中仅仅一小部分特定肿瘤细胞,将这类细胞移植入免疫缺陷小鼠后具有成瘤潜能； (2)这类细胞表达有区别于一般肿瘤细胞的特定细胞表面标记,可用流式细胞术及其他免疫选择方法对这些细胞进行鉴别和分选; (3)这类细胞既能产生具有成瘤潜能的肿瘤细胞也能产生不具有成瘤潜能的肿瘤细胞,是形成肿瘤异质性的基础。既往研究已证实CSC存在于包括乳腺、脑、血液、肺等多种肿瘤组织中。就NSCLC而言,相对于非CSC细胞,CSC常表达特异性CD44和(或)CD133分子,并富集于侧群细胞(side population,SP)中[33-35]。因此,在课题组前期研究基础上,本课题选用EGFR19外显子突变的NSCLC细胞株PC-9,用吉非替尼诱导产生EGFR-TKIs获得性耐药细胞PC-9/AB,通过逆转PC-9/AB细胞株EMT及诱导PC-9细胞株发生EMT获得相应的细胞株PC-9/AB-CDH1及PC-9/TGF-β1。先通过体外成球实验、体内成瘤实验等实验筛选出CD44和CD133何种为PC-9系列细胞的肿瘤标记分子,然后通过检测这些细胞株的干细胞标记来对每种细胞株中的CSC含量进行量化对比,进而探讨CSC生成与EMT介导的NSCLC EGFR-TKIs获得性耐药的关系,从而为提高EGFR-TKIs疗效探寻新靶点和新方法。方法1、EMT在PC-9/AB吉非替尼获得性耐药中的作用：我们首先选用EGFR基因19号外显子突变型人非小细胞肺癌细胞株PC-9,经吉非替尼诱导成获得性耐药细胞株PC-9/AB,观察PC-9/AB是否出现EMT,其次我们通过转染CDH1基因高表达E-cadherin逆转EMT后获得PC-9/AB-CDH1,PC-9用TGF-β1诱导PC-9发生EMT后获得PC-9/TGF-β1。根据细胞形态学变化及western blotting实验来检测各细胞株EMT情况。然后通过CCK8法检测各细胞株对吉非替尼的敏感性。为了排除吉非替尼获得性耐药由T790M突变及MET基因扩增所致,我们同时采用qPCR-HRM法检测细胞株T790M基因突变情况,采用FISH法检测细胞株MET基因扩增情况。2、筛查CSC特异性表面标记分子：我们首先采用流式细胞术检测各细胞株CD44与CD133的表达情况。确定两标记分子在各细胞株中均有表达后,我们采用MACS(magnetic-activated cell sorting)法将细胞株分选为CD44+、CD44-、CD133+及CD133-四群细胞。然后采用体外成球实验、体内成瘤实验及流式细胞术联合探讨CD44+、CD44-、CD133+及CD133-细胞的自我更新、分化及成瘤能力,从而确定CD133与CD44何种可作为CSC表面标记分子。3、PC-9与PC-9/AB两细胞株CSC含量对比：确定CSC表面标记物后,我们随即采用成球实验检测PC-9及PC-9/AB两细胞株的体外成球能力,采用流式细胞术检测PC-9及PC-9/AB两细胞株的侧群细胞含量,采用流式细胞术(根据细胞表面标记CD44及CD133)来检测PC-9及PC-9/AB两细胞株CD133+/CD44+细胞含量,从而联合对PC-9及PC-9/AB两细胞株的CSC含量进行量化对比。4、PC-9/AB与PC-9/AB-CDH1两细胞株CSC含量对比：我们首先予PC-9/AB转染CDH1基因获得PC-9/AB-CDH1.通过CCK8法检测转染前后细胞株对EGFR-TKI(吉非替尼)敏感性,并通过形态学变化及western blotting实验检测转染前后细胞株EMT情况,最后通过成球实验、流式细胞术来对转染前后细胞株的CSC含量进行量化对比,从而反向验证CSC是否与EMT介导的NSCLC EGFR-TKI获得性耐药有关。5、PC-9与PC-9/TGF-β1两细胞株CSC含量对比：用TGF-β1诱导PC-9获得PC-9/TGF-β1,通过CCK8法检测诱导前后细胞株对EGFR-TKI(吉非替尼)的敏感性,并通过细胞形态学变化及western blotting实验来检测诱导前后细胞株EMT’隋况,最后通过成球实验、流式细胞术来对诱导前后细胞株的CSC含量进行量化对比,从而正向验证CSC是否与EMT介导的NSCLC EGFR-TKI获得性耐药有关。6、统计学方法：应用Graphpad Prism5软件进行统计学分析,实验重复3次,数据以均数±标准差表示,组间比较采用t检验,当P<0.05时认为差异有统计学意义。结果1、EMT介导PC-9/AB吉非替尼获得性耐药 与亲代PC-9相比,耐药后PC-9/AB对吉非替尼敏感性下降,IC50分别为(0.07±0.04)μM与(10.85±2.64)μM(P<0.01)；与前期研究类似㈣,吉非替尼获得性耐药细胞PC-9/AB发生EMT改变,形态学表现细胞梭形,细胞连接疏松,免疫印迹实验证实PC-9/AB上皮型蛋白E-cadherin减少,而间质型蛋白Vimentin表达增加。基因检测显示PC-9/AB无T790M突变及MET扩增。对PC-9/AB转染CDH1后高表达E-cadherin可逆转EMT, PC-9/AB-CDH1对吉非替尼敏感性部分恢复,IC50为(1.31±0.47)μM(P<0.05)；用TGF-β1诱导PC-9发生EMT后PC-9/TGF-β1对吉非替尼敏感性下降,IC50为(6.73±2.19)μM(P<0.01)。2、CD133可作为PC-9系列肺癌细胞的CSC标记物 根据既往研究,非小细胞肺癌细胞常选用CD44与CD133作为CSC标记分子。为此,我们首先检测PC-9系列细胞株CD44与CD133的表达情况。流式细胞术显示CD133、CD44在各细胞株中均有表达,其中CD133+细胞在PC-9、PC-9/AB、PC-9/AB-CDH与PC-9/TGF-β1细胞株中所占百分比分别为0.11%、1.2%、0.26%与0.75%,CD44+细胞所占百分比则分别为94.1%、97.6%、95.5%与98.4%。为了进一步验证CD44及CD133是否可作为CSC表面标记分子,我们先用MACS细胞分选法将PC-9/AB细胞分为CD133+、CD133-、CD44+、CD44-四群细胞,然后利用流式细胞术、体外成球实验及体内成瘤实验联合给与验证。实验结果显示MACS分选法具有极高分选效率,从PC-9/AB分选出的CD133+细胞纯度第1天可达96.6%；分选培养两周后再分别对CD133-及CD133+细胞进行流式细胞术检测,细胞出现分化,CD133+细胞可产生CD133+/CD133-细胞,CD133+细胞比例下降至15.8%,而CD133-只能产生CD133-细胞。体外成球实验显示CD133+细胞成球能力远远大于CD133-细胞,成球数分别为(452±10.60)和(4.67±0.88),P<0.000。体内成瘤实验显示CD133+细胞成瘤能力显著强于CD133-细胞,前者只需103细胞即可成瘤,后者106细胞也未能成瘤。以上结果均提示,CD133+细胞具有极强的自我更新分化能力,CD133可作为PC-9系列细胞的CSC标记物。同理,我们也对CD44+/CD44-细胞进行了干细胞特性检测,实验结果显示：MACS分选的CD44+细胞纯度高达94.2%；分选出CD44-细胞与CD44+细胞,培养两周后均可产生CD44-与CD44+细胞；CD44+细胞与CD44-细胞的体外成球数分别为(76±12)和(63±15),P=0.446；CD44+细胞和CD44-细胞体内成瘤最低细胞数均为105个,成瘤速度与成瘤体积相当。综上,CD133+细胞具有显著的CSC特性,CD133可作为PC-9系列细胞株CSC表面标记分子。3、PC-9/AB细胞株发生EMT改变伴随着CSC含量增加 我们随即对PC-9及PC-9/AB的CSC含量进行量化对比。流式细胞术显示：PC-9/AB细胞株中CD133+细胞含量明显高于PC-9细胞株,百分比分别为(1.20%±0.22%)与(0.11%±0.02%),P=0.008。侧群细胞检测显示：PC-9/AB细胞株中侧群细胞比例明显高于PC-9,百分比分别为(1.32%±0.24%)与(0.14%±0.03%),P=0.008。肿瘤成球实验显示：PC-9/AB细胞株的成球能力显著强于PC-9,成球数分别为(71±9.5)与(18±4.5),P=0.007。4、逆转EMT后PC-9/AB细胞株中CSC含量降低 对EMT逆转后的PC-9/AB-CDH1进行CSC检测。流式细胞术显示：PC-9/AB-CDH1细胞株中CD133+细胞含量较PC-9/AB显著减低,百分比分别为(0.26%±0.05%)和(1.20%±0.22%),P=0.014。侧群细胞检测显示:PC-9/AB-CDH1细胞株中侧群细胞比例明显低于PC-9/AB,百分比分别为(0.34%±0.10%)和(1.32%±0.24%),P=0.019。肿瘤成球实验显示：PC-9/AB-CDH1细胞株的成球能力较PC-9/AB有所减弱,成球数分别为(23±6.1)和(71±9.5),P=0.013。5、TGF-β1诱导PC-9细胞发生EMT后伴随着CSC含量增加 经TGF-β1诱导两周后,PC-9/TGF-β1细胞株中CD133+细胞含量较PC-9显著增高,百分比分别为(0.75%±0.14%)和(0.11%±0.02%),P=0.01。侧群细胞检测显示：PC-9/TGF-β细胞株中侧群细胞比例明显高于PC-9,百分比分别为(0.96%±0.22%)和(0.14%±0.03%),P=0.022。肿瘤成球实验显示：PC-9/TGF-β细胞株的成球能力较PC-9显著增强,成球数分别为(60±11.27)和(18±4.5),P=0.026。结论本研究发现：NSCLC细胞在产生EGFR-TKIs耐药的过程中出现了EMT,这些细胞株均无T790M突变及MET扩增,诱导耐药后CSC含量显著增加；逆转耐药细胞的EMT可提高NSCLC细胞对EGFR-TKIs的敏感性,同时CSC含量相应降低：诱导敏感细胞发生EMT后可降低NSCLC细胞对EGFR-TKIs的敏感性,同时CSC含量相应升高。EMT是NSCLC EGFR-TKIs获得性耐药的重要机制之一,该机制可能与CSC生成增加有关。