水牛(Bubalus bubalis)是南亚重要的经济牲畜种类,具有许多良好的特性,例如耐粗饲,适应性强;乳品质量高,香味浓;生长快,利用年限长;水牛肉瘦肉多,脂肪少;水牛性情温驯,易于管理等。然而,其经济价值受到其低繁殖效率的限制。导致水牛繁殖效率低的因素很多,例如,水牛适合繁殖的年龄晚于黄牛和奶牛;雌性水牛在怀孕期间的黄体酮水平远低于黄牛;雌性水牛的发情特征不明显,且产犊间隔长于黄牛和奶牛;雌性水牛对生殖激素的处理也不敏感。值得注意的是,在实验室条件下,从水牛卵巢收集的适合于IVM(体外成熟)的卵母细胞的数量少于黄牛和奶牛,同时在附植前胚胎发育过程中,水牛的卵裂率和囊胚率低于黄牛,这表明水牛附植前胚胎发育过程中可能存在其特有的调节机制,而在合子基因组激活之前,胚胎的早期发育主要受母源基因组的调控。哺乳动物孤雌生殖是生殖生物学中一个重要的研究课题和研究模型,因为它不需要任何父源因子的参与,这使其成为研究母源基因组的理想模型。母源基因在调节网络中发挥作用,这需要许多基因的参与。因此,全景式地了解这些母源基因组在早期胚胎发育过程中的作用对解析母源蛋白质或基因之间的互作关系是很有必要的。到目前为止,还没有一个以孤雌生殖为研究模型,探索由母源基因组调控表达的蛋白质或基因(没有父源基因组干扰)在附植前胚胎发育过程中的蛋白质水平和转录组水平的动态变化的研究报告。因此,本研究以母源基因组作为研究水牛生殖机制的切入点,将基于串联质量标签(Tandem Mass Tag,TMT)标记的定量蛋白质组学与单细胞/单胚胎的转录组测序技术相结合,研究早期胚胎发育过程中母源基因组的动态功能,为提高我们对母源基因组学调控机制的认识,及改善体细胞核移植技术和孤雌胚胎干细胞技术奠定理论基础。本文的主要研究结果如下:一、水牛卵母细胞孤雌激活前后的定量蛋白质组学研究。对水牛卵母细胞激活前后差异表达的蛋白质进行鉴定,并进行生物信息学分析和数据挖掘,发现了这些重要的差异表达蛋白质最多涉及的是紧密连接和间隙连接等信号通路。使用实时荧光定量PCR反应(RT-PCR)和蛋白质印迹技术验证和分析了 4种参与缝隙连接和紧密连接的差异表达蛋白质(TUBB3,CTNNA1,CDH3,MAP2K1)在转录和翻译水平的表达规律,并且使用细胞免疫荧光对这些蛋白质的迁移和表达规律进行了分析。基于这些结果,推测由母源基因组调控表达的蛋白质在孤雌激活后可能首先在细胞连接的形成中发挥作用。二、水牛孤雌胚胎在附植前发育各个过程的单细胞/单胚胎转录组学研究。结合单细胞转录组测序技术,获得和分析了胚胎发育过程中的八个阶段(GV,MII,2-细胞,4-细胞,8-细胞,16-细胞,桑椹胚,囊胚)的转录组数据,共有3567个基因被鉴定为在附植前发育这些所有连续阶段中差异表达。同时研究还鉴定到了 10,442个新基因,并且通多对这些新基因的GO分析表明它们具有广泛的细胞定位并参与许多分子功能和生物学过程。此外,我们确定了 8个仅在特定发育阶段高度表达的聚类,并富集到了许多与特定阶段相关的GO聚类和KEGG通路。此外,从母源基因组调控表达的基因网络中鉴定到了 1,530个关键基因(hub genes),这些关键基因参与了 11个阶段特定的模块。使用Cytoscape 3.2.1软件进行可视化作图后,获得了这些关键基因的复杂的互作网络,这些互作关系主要集中在MII期,4细胞,16细胞-1,16细胞-2,桑椹胚-1和囊胚阶段。三、基于蛋白质组学和转录组学的联合分析,对水牛母源表达蛋白质或基因进行了初步的筛选和鉴定。在这部分的研究中,进行了水牛孤雌胚胎的转录组数据的表达聚类和相关性分析,同时结合在蛋白质组数据中鉴定得到的NPM2(核质蛋白质2)和NLRP5(胚胎需要的母体抗原,也称为Mater)在孤雌胚胎各个发育阶段的转录水平上的表达变化规律:即与所有其他阶段相比,在GV期中的这两个基因的mRNA表达量最高,在8-细胞阶段后,表达量显着降低,并且在囊胚期中几乎不表达。此外,分析了NPM2和Nlrp5是否具行组织表达特异性,发现它们仅在卵巢、MI[卵母细胞、2细胞期早期胚胎和颗粒细胞中表达,进一步说明NPM2和NLRP5可能是水牛的母源基因。基于以上结果,推测水牛孤雌生殖中可能也存在一个“母源基因组向合子基因组转变”(MZT)的过程,并且该过程可能发生在8细胞到16细胞阶段之间,这类似于正常的受精胚胎。四、为了分析研究中鉴定得到的孤雌激活后一些关键基因和蛋白质的在不同物种之间(人、小鼠和水牛)是否具有保守性,我们使用Blast软件进行同源性比对,并将在水牛中鉴定得到各阶段差异表达的基因和蛋白质的ID号转换成相应的人和小鼠的ID,并进行生物信息学分析(包括GO和KEGG等),将我们的结果扩展到小鼠和人类。我们发现,这些蛋白质或基因在不同物种间进行同源BLAST后发现它们显示出较高的序列相似性,这表明在水牛母源基因组的这些发现将对人和小鼠的母源基因组功能的研究有比较好的参考价值。综上所述,本研究通过使用水牛孤雌生殖为研究模型,将高通量的蛋白质组学和转录组学分析的技术体系应用于水牛母源基因组功能的研究,为进一步研究和筛选母源效应基因或蛋白质提供了丰富的数据资源,提高了我们对水牛母源基因组学在附植前胚胎发育过程中的调控机制的认识,为进一步改善体细胞核移植和胚胎干细胞技术奠定了理论基础。同时,本研究的策略和方法也可为其他物种探索母源基因组的功能提供有价值的参考。