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随着石油等化石燃料的日益枯竭以及人们环境保护意识的提升,作为可再生生物质能源的第二代燃料乙醇能源逐渐被人们所认可。与第一代燃料乙醇生产相比,第二代工业乙醇以各种农作物残渣为原料,除去了与人“争粮”的危害,并使这些纤维素原料得到较高的利用,减少了焚烧所造成的空气污染。酿酒酵母具有高糖和高乙醇耐受性,以及高乙醇发酵能力的优势,因而成为了燃料乙醇生产的首选菌株。然而天然的酿酒酵母菌株只能利用己糖进行发酵,而不能利用在纤维素原料中含量仅次于葡萄糖的木糖。因此葡萄糖和木糖在酿酒酵母中共发酵的研究对于第二代燃料乙醇的经济适用性尤为重要。课题组前期通过代谢工程改造和菌株的非理性进化获得了高效的木糖代谢酿酒酵母菌株。该菌株表达了低等真菌Piromyces s.来源的木糖异构酶基因(Pi-xylA),超表达内源木酮糖激酶基因以及非氧化磷酸戊糖途径的关键酶基因的改造以增加木糖代谢途径的流量;敲除GRE3基因减少木糖向木酮糖非特异性转化,敲除呼吸链中关键基因COX4,破坏菌株的呼吸链,去除呼吸作用对乙醇积累的影响。在此基础上,课题组通过长期在以木糖为唯一碳源的条件下对菌株进行非理性进化,获得了一株能够高效发酵木糖生产乙醇的酿酒酵母菌株,该菌株木糖异构酶酶活比进化前菌株显著提高。在更换了实验室自身发现的来自牛瘤胃宏基因组的木糖异构酶基因Ru-xylA(美国专利授权US 8586336B2)后,该菌株的木糖生长能力以及木糖异构酶的酶活与之前携带有其他木糖异构酶基因的菌株相似,但木糖异构酶活性提高的机理并未揭示。随后对该菌株进行了全基因组测序及进一步验证分析,发现8个纯合的SNPs位点和4个short InDels,但是各突变基因是否在提高菌株木糖代谢能力上发挥作用尚不清楚。本论文在前期工作的基础上,对12个突变基因进行敲除或超表达,分析对木糖代谢的影响。发现大部分基因对木糖代谢能力的提高没有正向作用。但是ASK10基因的突变和敲除,能够提高菌株在木糖上的生长能力以及木糖异构酶的酶活。研究发现该基因的敲除,能够通过提高质粒的拷贝数,提高木糖异构酶基因Ru-xylA的转录水平,从而提高木糖异构酶的酶活,使菌株的木糖代谢能力得到提高。但ASK10M475R突变基因虽然也使得木糖异构酶酶活增加,但并未影响质粒拷贝数。为进一步研究ASK10M475R突变基因提高木糖异构酶的原因,我们对携带有木糖异构酶途径ASK10M475R突变菌株及ask1O△菌株进行了转录组测序和分析,结合之前进化前后菌株的转录组数据,发现ASK10M475R突变可上调分子伴侣Hsp26p的表达,从而提高木糖异构酶的酶活,使菌株的木糖代谢能力得到提高。具体研究内容如下:1)驯化后菌株突变基因的敲除或超表达对木糖代谢影响的分析通过对驯化前后菌株的测序及后续的PCR重复验证,一共发现了 12个基因的突变,包括8个SNPs和4个short InDels。在仅引入Ru-xylA基因的原始菌株中对含有SNP的突变基因进行超表达,含有short InDel的基因进行敲除,通过葡萄糖和木糖上的点滴平板实验,发现大部分基因对木糖代谢能力的提高没有正向作用,但是只有ASK10基因的敲除及在敲除基础上超表达ASK10M475R能够提高菌株在木糖上的生长。进一步验证发现对ASK10基因在基因组上原位突变为ASK10M475R后同样能够提高酿酒酵母菌株在木糖上的生长,且在木糖上生长能力的提高是由于木糖异构酶活性的提高引起的。2)原位突变ASK10M475R功能分析Ask10p的功能主要是作为调控因子参与多种胁迫响应,如氧化胁迫等。为了验证ASK10M475R欠突变是否对于维持Ask10p的功能发挥重要作用,我们对原位突变的酿酒酵母菌株进行了 H2O2的点滴平板实验,发现ASK10M475R基因原位突变菌株对H2O2的敏感性显著提高,说明该突变位点对于维持ASK10基因的功能具有重要作用。3)ASK10基因的敲除提高酿酒酵母含有xylA基因的质粒拷贝数从而提高了木糖异构酶的酶活通过转录水平检测发现在ASK10敲除菌株Ru-xylA的转录水平明显上调,进一步测定发现,含有Ru-xylA的质粒拷贝数增加,因此ASK10敲除提高木糖异构酶酶活是通过增加质粒拷贝数实现的。而ASK10M475R基因原位突变菌株中虽然Ru-xylA的转录水平也有所提高,但质粒拷贝数没有明显变化。4)ASK10M475R上调分子伴侣Hsp26p的转录水平提高木糖异构酶的酶活为研究ASK10M475R基因原位突变提高木糖异构酶酶活的原因,我们对携带有木糖异构酶途径ASK10M475R突变菌株及ask10△菌株又进行了转录组检测,结合之前进化前后菌株的转录组数据,发现HSP26分子伴侣的转录水平在驯化后菌株及ASK10原位突变菌株中均有明显上调。进一步分析发现在原始菌株中超表达HSP26基因对于木糖异构酶的酶活提高具有积极作用。说明ASK10M475R原位突变在一定程度上提高分子伴侣编码基因HSP26转录水平进而提高木糖异构酶的酶活。