成人正畸治疗中常面临各种复杂的口颌疾患,其中最常见的是牙周病,特别是牙周情况不佳难以支持正畸牙的定向移动,导致牙齿松动甚至脱落。因此有效治疗和控制牙周病、促进牙周组织修复是成人正畸治疗前必须解决的问题。人类牙周膜细胞(Human Periodontal Ligament Cells,HPDLCs)是牙周组织再生的前体细胞,它是一种复杂的细胞群,包括成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞和间充质细胞等,研究表明牙周膜细胞具有成骨分化的潜能,这对牙周组织的修复极其重要。低强度脉冲超声波(Low Intensity Pulsed Ultrasound,LIPUS)作为一种非侵入性机械能能够刺激细胞分泌合成胶原、促进钙盐沉积,在长骨骨折以及牙周骨质缺损的修复中具有促进显著成骨效应。本课题前期实验证实LIPUS能够有效提高HPDLCs内碱性磷酸酶ALP活性,促进钙化结节形成。然而这些细胞成骨指标表达的具体调控机制尚未得到深入研究。成骨分化的调控因子骨形态发生蛋白BMPs是一种多功能生长因子,属于转化生长因子TGF-β家族的成员,这种活性蛋白能够使未分化细胞定向分化为成骨细胞,进而诱导成骨细胞标志物的增高,促进细胞外基质钙化,参与骨的再生修复。BMPs能够被细胞所感知,通过一系列信号分子的转导途径来调控成骨:当具有成骨分化潜能的细胞受外界因素刺激后合成BMP增加,在细胞膜上的BMP受体(BMPR)感受之后迅速与BMP结合,从而激活BMP信号传导。活化的受体BMPR作用于细胞质内下游的Smad1/5/8蛋白分子,使其末端的丝氨酸残基磷酸化,随后以异元二聚体分子的形式R-Smad-Co-Smad进入细胞核内,作用于细胞核内成骨特异性转录因子,从而调控各类成骨因子的表达。基于LIPUS对HPDLCs的潜在成骨效应,和BMP经典成骨通路的调控机制。本研究体外培养HPDLCs并建立细胞系,取第5代HPDLCs为研究对象,以LIPUS作为刺激因素,遴选前期实验所检测到的成骨最适参数:工作频率1.5MHz,脉冲重复频率1.0KHz,脉冲占空比1:4,幅宽200us,输出强度90mW/cm2,作用时间20min/day。连续处理HPDLFs2周,分别于辐照第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天、第13天后提取细胞RNA进行逆转录得到的cDNA,通过实时定量Real time-PCR技术检测人类牙周膜成纤维细胞中骨形成蛋白BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-9基因表达的动态变化趋势。结果发现LIPUS处理HPDLCs后BMP-2基因表达逐天增高,于第3天增高达峰值后,逐渐下降,再于第11天明显增加;BMP-4表达无明显变化;BMP-6表达于第1天开始明显增多,第3天达到峰值,以后逐渐恢复到初始水平;BMP-9在HPDLFs中无表达。说明LIPUS具有促进HPDLCs的BMP-2、BMP-6基因表达增强的能力,并且这种刺激对于BMP-2、BMP-6基因的作用在时间上是呈波段性变化的。此外LIPUS可能对HPDLF内BMP-4变化作用不大,而BMP-9在HPDLFs内无表达。为进一步探究LIPUS促进HPDLCs成骨分化的具体调控机制,由BMP经典成骨通路的Smads途径入手,验证细胞内信号分子Smads蛋白对LIPUS刺激的响应以及信号转导过程。取第5代HPDLCs,采用LIPUS(工作频率1.5MHz,脉冲重复频率1.0KHz,脉冲占空比1:4,幅宽200us,输出强度90mW/cm2,作用时间20min)进行处理。分别于处理后5分钟、处理后30分钟、处理后60分钟、处理后120分钟,和处理后4小时时间点收集细胞总蛋白,同期培养的未处理组作为空白对照。通过Western-Blot技术检测Smad1/5/8蛋白磷酸化的情况。结果显示HPDLCs内Phospho-Smad1/5/8在受到LIPUS处理后即开始增加,30min时显著上升,在60min持续增加,到120min达到峰值,在4h时明显下降。而Smad1/5/8总蛋白在60min时增加较多,其他时间点未见显著变化。这一部分实验证实HPDLCs在受到LIPUS刺激后,激活了BMP成骨经典途径的Smad1/5/8信号分子转导,出现了Smad1/5/8蛋白的短暂磷酸化以及去磷酸化过程。在前部分实验的基础上,进一步追踪Smads分子的信号传递路径。取第5代HPDLCs,仍采用LIPUS(工作频率1.5MHz,脉冲重复频率1.0KHz,脉冲占空比1:4,幅宽200us,输出强度90mW/cm2,作用时间20min)进行处理。分别于未处理、处理后1小时、处理后2小时、处理后4小时,和处理后8小时收集固定细胞。对HPDLCs进行免疫荧光染色,标记信号分子Smad蛋白。通过激光共聚焦显微镜观察Smad蛋白在细胞内的位置变化。结果发现未处理组的Smad蛋白基本位于细胞胞浆内,在受到LIPUS处理后1小时,Smad蛋白开始出现在细胞核内,说明已经开始将信号转移至细胞核。继续观察处理后2小时的Smad蛋白基本位于细胞核内。4小时时发现大多数细胞的Smad蛋白位于细胞核内,但已有少量开始向胞浆转出。8小时时间点的Smad蛋白已基本位于细胞胞质内。此部分实验证实HPDLCs在受到LIPUS处理后,细胞内BMP成骨转导通路被激活,并以Smad蛋白作为转导分子,将信号向细胞核内传递的过程。综上所述,本实验采用LIPUS(工作频率1.5MHz,脉冲重复频率1.0KHz,脉冲占空比1:4,幅宽200us,输出强度90mW/cm2,作用时间20min/day)作用于HPDLCs,发现细胞内骨形成蛋白BMP-2、BMP-6表达明显增强,并且随着时间的变化呈现出一个动态变化过程。进一步研究表明HPDLCs在LIPUS辐照刺激后,BMP成骨调控通路被激活,HPDLCs内的Smad1/5/8蛋白出现短暂的磷酸化以及去磷酸化过程。信号分子Smad蛋白由细胞质转移至细胞核,从而引起细胞核内转录因子的应答来调控成骨相关基因的表达。上述结果说明了LIPUS对HPDLCs的成骨效应,并且发现LIPUS对HPDLCs的成骨机制可能是通过BMP经典成骨通路Smads信号转导路径来实现的,这对进一步明确LIPUS促牙周组织修复作用机制提供借鉴。