【摘 要】
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目的:随着社会的发展和人们生活习惯的改变,由创伤或退变引起的关节软骨缺损逐年增多。然而,软骨缺损的修复在世界范围内仍然是一个具有挑战性的问题。骨形态发生蛋白2（BMP2）诱导的间充质干细胞（MSCs）成软骨分化是目前普遍认可的软骨组织工程成软骨方式。其通过促进Sox9的表达诱导MSCs成软骨分化。同时,BMP2也通过上调Smad7的表达诱导软骨细胞肥大和软骨内成骨,从而破坏软骨的形成。此外,研究发
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目的:随着社会的发展和人们生活习惯的改变,由创伤或退变引起的关节软骨缺损逐年增多。然而,软骨缺损的修复在世界范围内仍然是一个具有挑战性的问题。骨形态发生蛋白2（BMP2）诱导的间充质干细胞（MSCs）成软骨分化是目前普遍认可的软骨组织工程成软骨方式。其通过促进Sox9的表达诱导MSCs成软骨分化。同时,BMP2也通过上调Smad7的表达诱导软骨细胞肥大和软骨内成骨,从而破坏软骨的形成。此外,研究发现Smad7可被Sox9抑制,但其潜在机制尚不清楚。目前越来越多的研究显示micro RNA在成软骨及软骨病理生理过程中扮演着举足轻重的角色。本研究的目的是:（1）筛选出被Sox9上调,并以Smad7为靶点的micro RNA;（2）验证该micro RNA对软骨分化肥大、凋亡的作用;（3）体内外验证其对MSC成软骨分化的促进作用。材料和方法:（1）我们首先构建了三个以RFP标记的沉默Sox9的短发卡RNA序列,并以腺病毒为载体感染C3H10T1/2细胞,通过WB和q PCR验证这三个序列对Sox9的沉默效应,将沉默效应最佳的一个序列用于后续实验。接着在BMP2诱导前提下,沉默或不沉默Sox9表达,并在不同时间点检测组间成软骨标志物Sox9、COL2A1及Smad7的表达情况。同时对诱导情况下培养的微球进行Alcian Blue染色,观察沉默Sox9对蛋白聚糖合成的影响。以Sox9表达差异最显著的一个时间点的样品送二代测序,筛选组间差异表达的micro RNA,分析并绘制火山图、韦恩图、散点图、热图、GO富集图、KEGG富集图。在三个生信网站上进行分析,挑选出被Sox9上调,且预测靶向Smad7的差异基因。在不同时间点比较在BMP2诱导前提下,过表达Sox9,不干扰Sox9表达以及沉默Sox9三组间差异基因的表达情况,确认Sox9对该基因的诱导作用。并在BMP2诱导下,以antagomir和agomir分别抑制和促进该差异基因的功能,以PCR及WB检测Smad7的表达情况。最终由双荧光素酶报告系统确认该差异基因与Smad7的靶向关系。（2）在C3H10T1/2中差异化表达Sox9及筛选的差异基因,3天后进行流式细胞术检测该差异基因对早期凋亡率的影响。将胚胎18.5天的小鼠取出,前肢离断并去皮,差异化表达Sox9及筛选的差异基因,培养14天后,行组织切片、H＆E染色,镜下观察,分析差异基因对肥大区长度的影响。（3）在C3H10T1/2中差异化表达Sox9及筛选的差异基因,并进行微球培养,7天后以WB及PCR检测COL2A1,COL10A1,Smad7的表达情况,并对微球进行Alcian Blue染色。同时将相应处理的细胞注射到裸鼠皮下,3周后取出做H＆E染色、Masson染色,并以免疫组化检测COL2A1和COL10A1的表达。结果:（1）我们发现构建的三个序列均可抑制Sox9的表达,且以第二个序列抑制作用最佳。沉默Sox9可明显抑制BMP2诱导的成软骨作用。第二代测序和生物信息学分析提示Sox9上调miR-322-5P的表达,且后者可能靶向Smad7。双荧光素酶报告实验、q PCR、WB证实了miR-322-5p与Smad7之间的靶向关系。（2）流式细胞仪分析显示,与对照相比,miR-322-5p过表达组诱导的早期凋亡率明显降低,而miR-322-5p沉默组的凋亡率则明显升高。小鼠胎肢体外培养实验显示,miR-322-5p表达量与BMP2刺激的生长板肥大区长度负相关。（3）体外实验表明,miR-322-5p过表达明显抑制Smad7的表达,肥大标志物减少,而软骨标志物增加。体内实验也证实,miR-322-5p可协同BMP2对MSC的成软骨作用。结论:以上结果提示:（1）在BMP2诱导的MSC成软骨分化过程中存在Sox9/miR-322-5p/Smad7信号轴;（2）miR-322-5p可抑制Smad7对软骨细胞的肥大及促凋亡作用;（3）miR-322-5p协同BMP2诱导软骨形成。
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