目的1建立大鼠肾移植急性排斥反应模型,为研究急性排斥反应早期诊断及治疗提供实验动物模型。2了解大鼠移植肾急性排斥反应病理变化规律,了解CD44在大鼠移植肾的表达情况,探讨可溶性CD44分子在肾移植急性排斥反应大鼠外周血的表达情况。3收集临床病例,探讨CD44在排斥反应患者移植肾组织的表达,CD44在患者外周血的表达规律。方法1建立大鼠肾移植急性排斥反应模型SPF(清洁级)健康大鼠,由南方医科大学实验动物中心提供,动物实验遵守国家卫生部及南方医科大学动物条例,供体为wistar大鼠,体重300-350克,雌雄不限,SD雄性大鼠为受体,体重300-350克；供体麻醉后,经腹取双肾及足够长的腹主动脉和后腔静脉,置于0℃-4℃林格液中修整,结扎右肾动、静脉,切除右肾,剪去多余的脂肪组织,修整腹主动脉、后腔静脉；受体大鼠麻醉,开腹先切除受体大鼠原肾,移植肾置入,供体的腹主动脉和后腔静脉与受体的腹主动脉和后腔静脉端侧吻合,供体膀胱修剪为膀胱瓣,在受体膀胱上剪一直径3mm的切口,无损伤缝合线间断缝合,清点器械及辅料,依次关闭切口；手术后受体大鼠保温2小时至完全清醒活动,放入清洁笼内单笼饲养,当天禁食,给予5%葡萄糖盐水饮用,手术后第一天开始给予食物,术后观察精神状态、活动情况、饮食情况、体重增减、大便性状等。2 CD44在移植肾急性排斥反应大鼠中的表达同上建立大鼠肾移植急性排斥反应模型,实验动物分为排斥组(AR)、无排斥对照组(control)、正常组(normal)每组10只,分别于手术后3天、5天、7天、9天、14天各时间点,于移植肾的下极尖刀片切取小块肾组织,移植肾创面止血纱布压迫止血,关闭切口,肌注青霉素抗感染,常规病理染色观察移植肾大鼠急性排斥反应变化；于术后3天,5天,7天,9天,14天各时间点,断尾法采外周静脉血,纳入实验的正常组大鼠从实验开始第3天、5天、7天、9天、14天各时间点断尾法采外周静脉血,酶联免疫吸附法检测外周血可溶性CD44分子的表达(ELISA法)。3 CD44在肾移植患者急性排斥反应中的表达收集临床病例,此部分病例资料分3部分,各部分间有重复。第一部分从临床疑似急性排斥反应的患者中抽出28例行穿刺病理活检证实为移植肾急性排斥反应,另取28例慢性排斥反应移植肾失功而行移植肾切除的患者和28例正常肾组织,实验共分急性排斥反应组(AR)、慢性排斥反应组(CR)和正常组(normal)行免疫组织化学检测CD44在各实验组织中的表达；第二部分患者为2007-2009年间在暨南大学附属第一医院接受肾移植手术患者,13例行穿刺病理活检证实为移植肾急性排斥反应,分为急性排斥反应组(AR)和稳定组(stable),分别于患者移植前及移植后的第1天、3天、5天、7天、9天、14天各时间点,留取外周静脉血标本ELISA法检测CD44分子在排斥反应患者及稳定患者外周血表达浓度及配体透明质酸(HA)的表达浓度,取患者移植前外周血2ml流式细胞仪检测CD4+T、CD8+T淋巴细胞表面表达CD44情况；第三部分2007年以前行肾移植手术,2007-2009年间在暨南大学附属第一医院接受回访的患者,此部分患者有15例被穿刺活检病理确诊为急性排斥反应,分别于患者治疗前、后留取血标本ELISA法检测CD44分子外周血清表达浓度及配体透明质酸(HA)的表达浓度,流式细胞仪检测治疗前、后CD8+T淋巴细胞表面表达CD44情况；分别取13例和15例与上述两种患者同期手术的稳定患者,另外相应随机抽取13例和15例健康献血者静脉血标本检测相应指标作为正常参考值。结果1大鼠肾移植模型的建立用8个月时间进行急性排斥反应大鼠模型建立的实验研究,前3个月主要用来探索血管分离、供肾的原位灌注、血管吻合技术,共对50只大鼠进行肾移植术,这一阶段受鼠死亡率高,大多在术中或术后3-48 h内死亡,正式实验后,共对100只大鼠进行肾移植术,供受、体各50只,成功建立大鼠移植模型,30只大鼠存活超过2天,手术成功率60%(30/50),总手术时间为(130±20)min,供肾切取(40±5)min,受体血管游离(15±5)min,肾静脉吻合时间(25±5)min,动脉吻合时间为(20±5)分钟,膀胱吻合(8±2)min；近期并发症主要休克、腹腔内脏器损伤出血、吻合口出血、下腔静脉或动脉吻合口狭窄、下腔静脉或动脉吻合口血栓形成、肾蒂扭转等,远期并发症有淋巴瘘、尿瘘、膀胱吻合口狭窄等。2大鼠移植肾急性排斥反应病理变化术后第3天病理报告显示,两实验组肾小管结构、形态基本正常,排斥组部分大鼠肾组织间质有轻度小范围的淋巴细胞浸润,个别肾小管内有炎症细胞浸润,动脉未出现内膜炎,病理评分2分左右,对照组少量大鼠肾组织间质淋巴细胞浸润,浸润范围没有排斥组大,肾小管及动脉血管未见异常,病理评分1；排斥组在随后的病理发展过程中,肾组织间质被淋巴细胞浸润大鼠的数量增加,浸润范围扩大,被淋巴细胞浸润的肾小管比例增加,移植肾淋巴细胞浸润累及微血管,形成动脉内膜炎,并最终导致透壁性纤维素样动脉内膜炎,血管管腔狭窄,病理评分升高,对照组大鼠在移植后5天左右出现间质被淋巴细胞浸润,此后随时间的推移,炎症细胞浸润减少,无动脉内膜炎和透壁性纤维素样动脉内膜炎,两组间病理评分比较差异有统计学意义。3 CD44在大鼠移植肾组织的表达移植后第3天标本,在10例急性排斥反应肾组织中,有4例CD44呈阳性表达,阳性率为40%,阳性标本的CD44分子主要表达于肾小管、集合管、间质及其周围渗出的炎性细胞,对照组肾组织中,有3例阳性表达,阳性率为30%,表达范围为局灶性分布,正常大鼠肾脏弱阳性为2例,阳性率为20%；随时间的推移,急性排斥大鼠移植肾组织CD44表达阳性率增加,第14天时阳性率增高到90%,表达强度增强,表达范围扩大,对照组肾组织中CD44表达阳性率最高位60%,第14天时下降为30%,正常肾组织中CD44表达阳性率20%。4大鼠sCD44、HA的表达水平及比较排斥组sCD44血液中的表达水平随时间的增加而快速增加,对照组也随时间的增加而缓慢增加,正常组基本没有变化；sCD44表达水平重复测量数据方差分析显示,三组大鼠sCD44血液中的表达有显著性差异,5个时间点sCD44血液中的表达差异有显著统计学意义；HA的表达水平与sCD44有类似走势。5 CD44在人移植肾组织的表达在28例急性排斥反应肾组织中,有21例CD44呈阳性表达,阳性率为75%,其中强阳性表达6例,占总病例数的21.43%,中等阳性为7例,占总病例数的25%,弱阳性为8例,占总病例数的28.57%,CD44分子主要表达位于肾小管、集合管、间质及其周围渗出的炎性细胞；28例慢性排斥反应肾组织中,CD44表达阳性率为46.43%,表达范围为局灶性分布；28例正常肾脏组织中CD44表达阳性率为32.14%。对三组数据进行x2检验,CD44在三组中的表达差异有统计学意义。6围手术期患者移植前sCD44、HA及Cr水平排斥组患者移植前受者血清中sCD44水平为597.69±24.62 ng/ml,稳定组患者移植前受者血清中sCD44水平为573.08±13.03ng/ml,正常组的sCD44水平269.31±50.86ng/ml,经单因素方差分析,排斥组与稳定组相比较差异有统计学意义,正常组与排斥组和稳定组比差异均有统计学意义。排斥组血清HA水平为428.30±23.03ng/ml,稳定组血清HA水平为420.62±13.87ng/ml,正常对照组血清HA水平为66.77±9.10ng/ml;经单因素方差分析,排斥组与稳定组相比较差异无统计学意义,正常组与排斥组和稳定组比差异均有统计学意义。排斥组血清Cr水平为854.77±89.28ng/ml,稳定组血清Cr水平为838.15±66.07ng/ml,正常对照组血清Cr水平为65.08±15.67ng/ml；经单因素方差分析,排斥组与稳定组相比较差异无统计学意义,正常组与排斥组和稳定组比差异均有统计学意义。7围手术期患者移植后sCD44、HA及血Cr水平排斥组移植后前3天sCD44下降趋势不明显,3天后开始sCD44水平快速升高,第6-7天达高峰值844.23 ng/ml,急性排斥反应扭转后sCD44水平开始下降,第14天下降到413.30±26.02ng/ml,仍然高于稳定组；稳定组sCD44水平较移植前呈大致降低趋势,从术前的575.13±27.66ng/ml下降到第14天的413.30±26.02ng/ml,第14天排斥组和稳定组sCD44浓度仍高于正常人组的241.67±41.27ng/ml；排斥组和稳定组sCD44表达水平重复测量数据方差分析显示,排斥组与稳定组比较差异有显著统计学意义,6个时间点sCD44血液中的表达差异有显著统计学意义；HA及Cr的表达水平与sCD44有类似。对排斥组sCD44与HA和Cr之间进行相关分析,排斥组术后外周血sCD44与外周血Cr经相关分析r=0.619,p=0.024,两者呈正相关关系；排斥组术后外周血sCD44与外周血HA经相关分析r=0.731,p=0.005,两者呈显著正相关关系。8回访患者治疗前后外周血sCD44、HA及Cr水平排斥组发生排斥反应时血sCD44水平为841.85±43.71ng/ml,治疗后354.12±58.33ng/ml,稳定组为224.57±17.60ng/ml,治疗后sCD44水平接近稳定组,对sCD44表达水平进行t检验分析,治疗疗前、后与稳定组三者之间相互比较sCD44表达水平差异均有有统计学意义。HA及Cr均呈现类似现象。9移植术前T淋巴细胞表达CD44水平急性排斥组CD8+CD44+T淋巴细胞百分比为8.75±1.01,稳定组CD8+CD44+T淋巴细胞百分比为9.73±0.61,排斥组较稳定组低,经独立样本t检验,两者相比较差异极显著,有统计学意义(P<0.01)；急性排斥组CD4+T/CD8+T淋巴细胞计数比值为1.32±0.25,稳定组CD4+T/CD8+T淋巴细胞计数比值为1.23±0.14,排斥组较稳定组高,经独立样本t检验,两者相比较差异无统计学意义(P>0.05)；急性排斥组CD4+T百分比40.76±4.67,较稳定组的37.74±4.76高,经独立样本t检验,两者相比较差异无统计学意义(P>0.05)；急性排斥组CD44+T百分比19.34±2.14,较稳定组的21.55±1.94低,独立样本t检验,两者相比较差异极显著,有统计学意义(P<0.01)；CD8+T、CD4+CD44+T两组见比较差异均无统计学意义。排斥组术前外周血CD8+CD44+T百分比与术前外周血sCD44经相关分析r=-0.912,p=0.000,两者呈显著负相关关系；排斥组术前外周血CD8+CD44+T百分比与术前外周血HA经相关分析r=-0.697,p=0.008,两者显著负无相关；排斥组术前外周血CD8+CD44+T百分比与术前外周血Cr经相关分析r=0.205,p=0.501,两者无相关。10回访患者治疗前后CD8+CD44+T的变化排斥组发生排斥反应时外周血CD8+T百分比为30.46±1.64,治疗后为29.06±1.62,稳定组为29.78±1.62,对CD8+T百分比进行t检验分析,治疗前、后与稳定组CD8+T百分比三者之间相互比较差异无统计学意义。排斥组发生排斥反应时外周血CD8+CD44+T百分比为8.47±0.46,治疗后为9.77±0.60,稳定组为9.78±0.61,对CD8+CD44+T百分比进行t检验分析,治疗前后CD8+CD44+T百分比差异有显著统计学意义,治疗前与稳定组CD8+CD44+T百分比差异有显著统计学意义,治疗后与稳定组CD8+CD44+T百分比差异无统计学意义。结论1本实验在已有的实验术式基础上,经过技术改进,成功地构建了大鼠肾移植急性排斥反应模型,为下一步实验研究提供了必要条件。2通过实验研究显示Wistar→SD大鼠组合建立的肾移植急性排斥反应模型,移植肾术后出现明显的排斥反应,无免疫耐受出现,无大鼠长期存活纪录,Wistar→SD大鼠组合可以用来建立急性排斥反应模型；Wistar→Wistar大鼠肾移植后,排斥程度轻微,Wistar→Wistar大鼠可以作为大鼠肾移植急性排斥模型的无排斥对照组。3本研究证实CD44分子在大鼠急性排斥移植肾组织中表达增强,与无排斥对照组及正常肾组织相比较,差异有统计学意义。4通过本实验得出结论可溶性CD44分子及其配体透明质酸在移植肾大鼠血液中表达明显增高,而对照组无表达或表达低。5CD44分子在人急性排斥肾组织中表达增高,高于慢性排斥反应肾组织和正常肾组织。6患者移植术前sCD44表达水平高于稳定组,而术前外周血CD8+CD44+T百分比、CD44+T百分比低于稳定组。7移植术后急性排斥反应发生前外周血sCD44和HA表达升高,急性排斥反应逆转后sCD44和HA表达水平下降。8急性排斥反应发生前外周血CD8+CD44+T百分比降低,急性排斥反应逆转后CD8+CD44+T百分比升高。9 CD44分子与其配体透明质酸相互作用参与了实验性急性排斥反应的病理进展,CD44分子与急性排斥反应的关系密切,但具体作用机制需进一步研究。