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乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)转录后调节元件(HBV posttranscriptional regulatory element, HPRE)是位于HBV基因组内的一段调控序列。因其在转录后水平调节HBV的基因表达而命名。它对HBV基因的高表达是非常重要的。自从1993年被Huang J等发现后,它的功能机制及与其相互作用的蛋白因子一直是人们的研究热点。虽然HPRE的作用机制至今还不是完全清楚,但比较一致的认为是HPRE依赖与细胞蛋白的结合来发挥它的作用,因此验证HPRE结合蛋白就可以帮助明确HPRE在HBV生活周期中发挥的作用。多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein,PTB)就是已经鉴定出的能和HPRE结合的一种核蛋白。目的:表达纯化大量PTB-His融合蛋白,体外验证PTB与HPRE RNA之间的结合作用;利用CAT检测系统pDM138-HPRE验证PTB对HPRE功能的影响;用HepG2.2.15细胞系、HBs-HPRE瞬时转染Hela细胞探讨PTB对HBV基因表达的作用机制。方法:1.用XhoI酶切线性化pGEM-11zf-HPRE质粒DNA,利用T7RNA聚合酶,以体外转录地?ê铣葿iotin-HPRE RNA。2.在BL21细菌里大量诱导、表达及纯化PTB-His融合蛋白及His蛋白。3.生物素标记的HPRE RNA与His或者PTB-His融合蛋白在冰上孵育结合,M-280 Streptavidin磁珠特异性结合生物素,用磁力座纯化混合物,将纯化后的洗脱液做Western Blot分析,用Ni-NTA HRP conjugate检测有无蛋白存在;用能特异性结合His蛋白的镍珠纯化PTB-His融合蛋白与HPRE RNA的结合液,将纯化后的洗脱液做RT-PCR,检测有无HPRE RNA存在。4.将PTB的真核表达质粒PCMV-SPORT6-PTB和pDM138-HPRE共转染Hela细胞,通过ELISA检测报告基因CAT的表达,以验证PTB与HPRE RNA相互结合所发挥的作用。5.将PTB的真核表达质粒PCMV-SPORT6-PTB转染HepG2.2.15细胞,将质粒PCMV-SPORT6-PTB分别和HBsAg的真核表达质粒pcDNA3.1-HBsAg、pcDNA3.1-HBsAg-HPRE共转染Hela细胞,通过ELISA检测HBsAg的表达量和统计学分析,验证PTB对HBsAg表达的影响。结果: 1.在Western Blot实验中,样品PTB-His+Biotin-HPRE RNA有蛋白带存在,而阴性对照His+Biotin-HPRE RNA没有条带。RT-PCR电泳结果显示样品PTB-His+Biotin-HPRE RNA有HPRE RNA存在,而阴性对照His+Biotin-HPRE RNA没有。2.报告基因CAT表达量经统计学处理后显示:转染质粒pDM138-HPRE的细胞能高表达CAT,同时转染质粒pDM138-HPRE和PCMV-SPORT6-PTB之后,CAT的表达受到明显抑制,并且抑制作用不依赖于上游剪接位点的存在。3. ELISA检测S抗原的表达量,统计学处理后显示:与正常的HepG2.2.15细胞相比,转染PCMV-SPORT6-PTB质粒的HepG2.2.15细胞,其S抗原表达量有明显的降低。对比单纯转染pcDNA3.1-HBs和pcDNA3.1-HBs-HPRE的两组实验,后一组HBsAg的表达量是前一组的3倍多。对比仅转染pcDNA3.1-HBs-HPRE ,共转染pcDNA3.1-HBs-HPRE和PCMV-SPORT6-PTB,HBsAg的表达活性下降了2倍多。而对比仅转染pcDNA3.1-HBs,共转染pcDNA3.1-HBs和质粒PCMV-SPORT6-PTB,HBsAg的表达活性无明显变化。这些结果表明PTB能通过HPRE负性调控HBsAg的表达。结论:PTB与HPRE能够结合,为HPRE的抑制性结合蛋白,能负性调节HBsAg的基因表达。