过敏性炎症如过敏性皮炎、过敏性哮喘等属2型免疫反应(Type2immunity)导致的疾病,以2型细胞因子白介素(Interleukin,IL)-4、IL-5、IL-9和IL-13等的产生为主要特征。本课题组前期研究发现益气固表经典名方玉屏风散(YPFS)及其效应成分毛蕊异黄酮、芒柄花素、升麻素、黄芪甲苷等缓解期给药可明显减轻屋尘螨(Housedust mite,HDM)诱导的过敏性哮喘复发(Allergic asthmarecurrence)以及异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyante,FITC)诱导的小鼠过敏性接触性皮炎(Atopic contact dermatitis,ACD)复发,且效应水平并不亚于地塞米松等药物激发期用药。由此可见YPFS缓解期给药可显著改善过敏性疾病复发,且有区别于其他临床抗过敏药物的特点。此外,我们的前期研究还发现YPFS抗过敏性炎症与其恢复上皮细胞(Epithelial cells,EC)间屏障相关,但EC屏障损坏持续存在的深层影响因素是什么?YPFS缓解期用药发挥独特效应作用的下游靶细胞是什么?传统认为,抗原特异性的记忆性T细胞是过敏性炎症的反复发作中最重要的免疫应答细胞。近年来学界对先天免疫系统(Innate immune system)中2型固有淋巴细胞(Type 2 innate lymphoid cells,ILC2s)在过敏性疾病的重要贡献越来越重视。EC屏障受损后释放的大量促过敏性因子IL-33、IL-25和胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)可直接激活ILC2s进而大量释放IL-5、IL-13等2型炎性因子,可通过进一步激活2型辅助性T细胞(T helper2 cells,TH2)放大或直接引发过敏性炎症反应。此外,课题组前期己发现在FITC诱导的小鼠过敏性皮炎复发模型缓解期ILC2细胞(而非TH2细胞)仍大量存在于引流淋巴结中,YPFS可显著减少其数量,提示在过敏性炎症反应中ILC2细胞可能也扮演重要角色,ILC2s可能是YPFS抑制过敏性疾病复发的关键靶细胞。不同于抗原特异性T细胞,ILC2s在机体再次受到非相同抗原刺激时也会发生急剧的活化和2型细胞因子的分泌。过敏性疾病患者往往对多种过敏原都有反应,也是过敏性疾病易反复发作的原因,ILC2s的非特异性“记忆”功能恰恰可以解释这个现象。近年来不断有研究表明,某些特定亚型的ILC2s具有与记忆性T细胞类似的免疫“记忆”样特征,能够在机体再次受到过敏原刺激时迅速从静息部位迁移至刺激部位诱发免疫反应。但是,目前学界对于究竟何种亚型ILC2s能够进行体内迁移及发挥“记忆”样功能仍然存在争议,且争议主要集中在这类ILC2s表面marker是IL-33R/ST2或是IL-17RB/IL-25R,以及杀伤细胞凝集素样受体G亚族成员1(Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1,KLRG1)分子阳性/高表达或是阴性/低表达等。因此,本文拟基于ILC2s从以下几方面继续深入探索YPFS抗过敏性炎症作用机制及作用机理:(1)探索过敏性炎症中ILC2s体内迁移及“记忆”样特征:在过敏性皮炎、过敏性哮喘模型基础上考察何种亚型ILC2s可能存在体内迁移、“记忆”样特征,同时YPFS能否影响这些ILC2s的分布、数量及功能。①在C57/BL6J小鼠上复制ACD模型,末次激发24h后取材,考察局部(耳部引流淋巴结)和外周血中ILC2s数量变化,分析哪些marker标记的ILC2细胞可在ACD造模后由局部部位迁移至外周循环中;②运用HDM复制为期30天的小鼠哮喘复发模型,缓解期第24～30天(D24～30)连续7天给予YPFS,考察不同marker标记的ILC2s在小鼠气管、肺、纵隔淋巴结、小肠固有层、肠系膜淋巴结以及外周血等部位的分布、数量,同时比较不同定义ILC2s一些表面分子、炎性因子的几何平均荧光强度(Delta mean fluorescence intensity,ΔMFI),从而探讨模型缓解期可能的“记忆”亚型ILC2s具备体内迁移的能力以及给予YPFS后对此类ILC2s的影响;③在HDM诱导的哮喘模型建立后设置多个时间点考察Lin-KLRG1+IL-25R+ILC2细胞在各部位存留时间,以确认该亚型细胞具有“记忆”能力;④我们在HDM哮喘模型进行两次激发(分别为D21～23和D31～33),设置D23-6h、D24、D27、D30、D34、D37、D40等时间点取材,考察Lin-KLRG1+IL-25R+ILC2细胞在小鼠气管、肺、纵隔淋巴结、小肠固有层、肠系膜淋巴结以及外周血等部位的分布、数量随激发后时间不同的动态变化情况。(2)哮喘患者“记忆”样ILC2s的数量、功能及YPFS的影响:体外实验考察YPFS及其活性成分升麻素(cimifugin)对人原代“记忆”样ILC2s数量及功能的影响。①运用梯度离心法提纯分离健康人、临床过敏性哮喘患者外周血单个核细胞(PBMC),考察健康人、过敏性哮喘患者外周循环中Lin-CRTH2+KLRG1+IL-25R+ILC2细胞数量及其功能;②体外培养运用梯度离心法联合磁珠分选法提纯分离的健康人或过敏性哮喘患者外周血原代Lin-细胞使其增殖,而后利用HDM或IL-25刺激,YPFS或升麻素孵育后,考察Lin-CRTH2+KLRG1+IL-25R+ILC2s数量及其功能变化;③考察病人来源的“记忆”样ILC2s与上皮细胞之间相互作用,进一步考察过敏性哮喘病人体内“记忆”样ILC2s功能。体外培养运用梯度离心法联合磁珠分选法提纯分离的健康人或过敏性哮喘患者外周血中原代ILC2细胞,并与极化后的人支气管上皮细胞16HBE进行共培养,考察在HDM刺激、YPFS孵育等不同条件作用下“记忆”样ILC2s数量、功能以及支气管上皮细胞屏障变化。(3)分析确认过敏性哮喘缓解期“记忆”样ILC2s体内迁移特点及其依赖的信号,并考察YPFS能否有效抑制“记忆”样ILC2s的体内迁移。①对γ射线辐照后的CD45.2小鼠与CD45.1小鼠进行异种共生(Parabiosis)手术,6周后两只小鼠间形成微脉管,共用循环系统。用HDM对CD45.1小鼠建立过敏性哮喘模型,缓解7天期间给予CD45.1小鼠YPFS。D30取材检测每对异种共生(Parabiosispair)小鼠气管、肺、纵隔淋巴结、小肠固有层、肠系膜淋巴结以及外周血中Lin-CD45.1+KLRG1+IL-25R+ILC2s数量变化;②CD45.1小鼠上建立HDM诱导的过敏性哮喘模型,缓解7天后提纯分离小肠、肺、脾以及骨髓中总的白细胞,分别过继转移至CD45.2小鼠体内,用HDM滴鼻刺激,考察CD45.2小鼠气道反应性、肺部炎症等哮喘模型相关指标,同时检测CD45.2小鼠肺部“记忆”样ILC2s(Lin-CD45.1+KLRG1+IL-25R+)数量变化。③通过分析HDM诱导的过敏性哮喘模型中“记忆”样ILC2细胞上CCR9、α4β7、S1PR等细胞迁移相关marker及各组织部位这些marker对应配体的水平变化,确认“记忆”样ILC2s体内迁移相关机制,同时考察YPFS对这些迁移依赖分子的影响。(4)进一步验证YPFS抑制过敏性炎症的效应依赖于其对“记忆”样ILC2细胞的干预作用。①Rag1-/-小鼠(T、B淋巴细胞缺失)上运用过敏性哮喘模型建立方法进行HDM致敏激发,同时设置KLRG1抗体中和组,对比模型效应以评估在T、B细胞缺失的情况下Lin-KLRG1+IL-25R+ILC2细胞能否直接引发小鼠过敏性哮喘样病理反应;②将过敏性哮喘模型缓解期Rag1-/-小鼠小肠固有层中分离出的总的白细胞回输至YPFS给药组小鼠体内,再用HDM直接滴鼻刺激后观察YPFS对小鼠过敏性哮喘复发病理变化的改善作用是否被反转以评估YPFS是否通过调控“记忆”样ILC2s发挥其效应。研究结果:(1)Lin-KLRG1+IL-25R+ILC2是具有“记忆”样特征,其在体内存在组织间迁移;YPFS可调节Lin-KLRG1+IL-25R+ILC2数量及功能:①ACD模型小鼠耳部引流淋巴结中Lin-CD25+ST2-ILC2细胞(而非Lin-CD25+ST2+ILC2细胞)显著下调,外周血中明显增多,提示在局部出现炎症反应后ST2-的ILC2细胞可能会由局部进入外周循环;更多的marker标记综合分析后提示在ACD模型中Lin-KLRG1+IL-25R+这类ILC2细胞可能会从局部迁移至外周循环中;②HDM诱导的过敏性哮喘模型缓解期小鼠肺部和小肠中依然存在显著增多的Lin-KLRG1+IL-25R+ILC2,而外周血、气管、纵隔淋巴结、肠系膜淋巴结中无显著变化,提示Lin-KLRG1+IL-25R+ILC2细胞可能在机体静息状态下部分存留在肺部,部分迁移至小肠部位,这类细胞可能是具有“记忆”样特征的ILC2细胞。而YPFS给药能够显著下调小鼠肺部和小肠中的Lin-KLRG1+IL-25R+ILC2s,同时也能降低ILC2s产生IL-13(而非IL-5)的水平;③HDM诱导的过敏性哮喘模型缓解1、30、60、90天后,小鼠小肠固有层中依然存在大量Lin-KLRG1+IL-25R+ILC2s,其存留时间之久提示我们此亚型ILC2具备“记忆”功能,而小肠可能是这类细胞在机体静息状态下驻留的部位;④过敏性哮喘模型中,Lin-KLRG1+IL-25R+ILC2细胞在小鼠气管、肺、纵隔淋巴结、小肠固有层、肠系膜淋巴结以及外周血等部位的分布、数量随HDM激发后时间不同存在动态变化。这些细胞在PBMC中出现的首次高峰为D23-6h,随后不断降低直到D34即第二次激发后24h再次出现另一个高峰。而“记忆”样ILC2s在D23-6h时即大量出现在肺部,D24出现第一个高峰,随后D34出现第二个高峰。在小肠部位,“记忆”样ILC2s的数量高峰出现在D24,随后D27、D30均保持较高数量,D34即第二次激发后反而大幅减少,D37、D40又不断增多。这些结果提示我们“记忆”样ILC2s可能在哮喘模型效应阶段部分于肺部、部分于外周不断增多,发挥其效应作用;而在缓解期“记忆”样ILC2s可能迁移至小肠部位,直到气道再次受到HDM刺激时,这些“记忆”样ILC2s迅速迁移至肺部发挥效应功能。(2)Lin-CRTH2+KLRG1+IL-25R+ILC2细胞在临床过敏性哮喘患者外周循环中大量存在,也具有“记忆”样特征,并与上皮细胞存在相互作用;YPFS能够显著抑制其数量及功能:①过敏性哮喘病人外周血中Lin-CRTH2+KLRG1+IL-25R+ILC2细胞明显多于健康人,同时过敏性哮喘患者血浆中IL-13水平对比健康人也明显较高;体外培养HDM与IL-25作用类似,均能显著刺激Lin-CRTH2+KLRG1+IL-25R+ILC2s大量增殖,而来自过敏性哮喘患者的原代细胞对于刺激更为敏感,“记忆”样ILC2s数量显著增多,且释放的IL-13水平也显著性升高。YPFS既可以明显下调刺激后“记忆”样ILC2s数量,也可以抑制“记忆”样ILC2s释放的IL-13。结果说明Lin-CRTH2+KLRG1+IL-25R+ILC2细胞在临床过敏性哮喘患者外周循环中大量存在,也具有“记忆”样特征,YPFS能够显著抑制其数量及功能;②Transwell小室上室加入HDM可下调气液交界培养极化后的16HBE的跨膜电阻,破坏上皮屏障,该作用与上皮细胞间DSG1、CLDN1蛋白显著减少有关。培养基中IL-25水平明显升高;健康人ILC2s与气液交界培养极化后的16HBE共培养后上述上皮屏障破坏作用更加显著,培养基中IL-5、IL-13高水平表达。而过敏性哮喘患者来源的ILC2s效应较健康人更明显。结果说明上皮屏障破坏后释放的IL-25可激活ILC2s,从而大量释放2型细胞因子,反过来进一步破坏上皮屏障蛋白。因此ILC2s与上皮细胞间的相互作用可能是“记忆”样ILC2s发挥其效应作用的重要作用机制之一。(3)“记忆”样ILC2s具有体内迁移特点,在缓解期主要驻留在小肠部位;YPFS能抑制“记忆”样ILC2s的体内迁移。①异种共生术后6周,HDM诱导CD45.1小鼠过敏性哮喘缓解期,其肺部、纵隔淋巴结、小肠、肠系膜淋巴结中“记忆”样ILC2s显著增多,而CD45.2小鼠体内这些部位也检测到明显增多的CD45.1阳性的Lin-KLRG1+IL-25R+ILC2细胞,说明“记忆”样ILC2s具有体内迁移功能。而YPFS能够同时减少CD45.1和CD45.2小鼠各部位“记忆”样ILC2s数量,说明YPFS能够显著抑制“记忆”样ILC2s的体内迁移;②过敏性哮喘缓解期CD45.1供体小鼠各部位提取纯化的总白细胞经尾静脉注射过继转移至CD45.2受体小鼠体内后,仅小肠固有层来源的白细胞能够诱导受体鼠在HDM滴鼻刺激后迅速出现气道高反应性、肺部2型炎症等过敏性哮喘样症状,说明小肠可能是“记忆”样ILC2s在机体静息状态下驻留的部位;③“记忆”样ILC2细胞上CCR9、α4β7高表达,而过敏性哮喘模型小鼠缓解期小肠中存在高水平CCL25、MAdCAM-1,说明过敏性哮喘缓解期“记忆”样ILC2细胞依赖于CCR9、α4β7归巢至小肠。“记忆”样ILC2细胞上S1P1高表达,第二次激发后小鼠外周血中S1P水平明显升高,因此“记忆”样ILC2细胞在机体再次受到过敏原刺激后可能依赖于S1P信号进入淋巴管内,从而通过循环系统迁移至肺部发挥其效应作用。YPFS给药可显著下调模型小鼠缓解期小肠中CCL25、MAdCAM-1水平,从而抑制“记忆”样ILC2细胞迁移至小肠。(4)KLRG1是保持ILC2s“记忆”特征的关键分子,YPFS抗过敏性炎症的作用依赖于“记忆”样ILC2细胞。①过继转移HDM诱导的过敏性哮喘模型小鼠小肠中分离出的CD3-白细胞至T、B细胞缺失的Rag1-/-小鼠体内,直接用HDM滴鼻刺激Rag1-/-小鼠即可迅速诱发其气道高反应性、血中嗜酸性粒细胞及IgE明显升高、肺部2型炎症等过敏性哮喘样症状。而KLRG1抗体能反转上述现象,说明KLRG1是保持ILC2s“记忆”特征的关键分子;②YPFS效应被“记忆”样ILC2细胞移植逆转,说明YPFS是通过调控“记忆”样ILC2细胞发挥其抗过敏性炎症效应的。综上我们可以得出结论:①机体受过敏原刺激后可能产生大量具有“记忆”样特征和体内迁移功能的Lin-KLRG1+IL-25R+ILC2细胞,这些细胞能够在机体受过敏原刺激后大量增殖;②这些细胞在过敏性炎症缓解阶段可能依赖于CCR9和α4β7归巢受体信号迁移至小肠部位。而机体不同部位再次受到不同过敏原刺激后,这些“记忆”样ILC2细胞可依赖于S1P信号进入淋巴管从而经循环系统迁移至受刺激部位迅速发挥其效应作用;③“记忆”样ILC2s与上皮细胞之间存在相互作用关系,这可能是“记忆”样ILC2s发挥效应重要机制之一;④YPFS能够调控Lin-KLRG1+IL-25R+ILC2细胞的“记忆”与体内迁移;⑤Lin-KLRG1+IL-25R+ILC2细胞的“记忆”与体内迁移特性可能是机体某些情况下受到不同过敏原刺激时不同部位发生过敏性炎症的重要原因,而YPFS能够通过干预“记忆”样ILC2s发挥抗过敏性炎症效应,这是YPFS区别于目前临床常用治疗过敏性疾病药物的独特优势。